Alzheimer’s disease is a progressive neurodegenerative disease characterized primarily by memory impairment and cognitive decline. As of 2020, an estimated 50 million people suffer from Alzheimer’s disease or related dementia and no disease-modifying treatment options are yet approved for clinical practice. A major pathological feature of Alzheimer’s disease is the presence of cerebral senile plaques with aggregated amyloid beta (Aβ) peptides as the main constituent. In this thesis, Aβ is used in five separate studies either as a target for the development of potential biotherapeutical interventions or as a tool in biotechnological research.

In the first study, a high-throughput screening method was developed that enables functiondriven selection of protein-based aggregation inhibitors from combinatorial libraries. The method employs a reporter protein consisting of Aβ42 fused to the N-terminus of green fluorescent protein (GFP). The reporter protein misfolds due to the aggregating nature of Aβ42. Following protein expression in Escherichia coli a low whole-cell GFP fluorescence signal was detected using flow cytometry. However, when co-expressed with an affibodybased aggregation inhibitor, the reporter protein was rescued from aggregation and an increased whole-cell GFP fluorescence signal was detected in flow cytometry. By combining the screening method with flow cytometric cell sorting, the aggregation-inhibiting affibody molecule could successfully be enriched from a large background of non-inhibiting affibody molecules. The results thus demonstrated that the developed method enables highthroughput screening and sorting of combinatorial protein libraries based on the Aβ aggregation inhibiting ability.

The second study explored a strategy to increase the uptake of a biotherapeutical candidate protein into the central nervous system (CNS) via receptor-mediated transcytosis across the blood-brain barrier (BBB). The affibody-based candidate ZSYM73 binds monomeric Aβ and inhibits Aβ aggregation. Here, ZSYM73 was fused to the C-terminus of a single-chain variable fragment (scFv8D3) binding the transferrin receptor (TfR); a receptor expressed on the BBB. An engineered albumin-binding domain (ABD) was fused to ZSYM73 to extend the circulatory half-life of the fusion protein. In a mouse study, the tri-specific fusion protein scFv8D3-ZSYM73-ABD exhibited increased cerebrospinal fluid (CSF) bioavailability compared to the control protein ZSYM73-ABD, indicating an active transport mechanism into the CNS.

In the third study, a novel method for combinatorial protease engineering was developed and applied to generate highly proteolytic active variants of the coxsackievirus 3C protease. The method is based on the findings form the first study and employs a reporter protein consisting of Aβ42 fused to the N-terminus of GFP via a peptide linker containing a protease substrate sequence. The reporter protein misfolds upon expression in E. coli, which resulted in a low whole-cell GFP fluorescence signal detected in flow cytometry. Co-expression of a protease with activity on the substrate sequence led to proteolytic separation of the aggregation-prone Aβ42 peptide from GFP and restored whole-cell fluorescence. This method was used in combination with flow cytometric cell sorting to isolate highly proteolytic active variants from a randomly mutated 3C protease library. The aim of the fourth study was to evaluate the potential of the newly developed method from the third study to engineer the substrate specificity of proteases. A semi-rational tobacco etch virus (TEV) protease library was screened for variants with proteolytic activity on a novel target substrate. The target substrate differed substantially from the wild-type TEV consensus substrate and exhibited high sequence similarity to the aggregation-inducing hydrophobic core region of Aβ. After three rounds of flow cytometric cell sorting, a set of TEV protease variants was enriched that exhibited proteolytic activity on the novel substrate.

In the fifth study, a methodology employing flow cytometric sorting of multiprotein aggregates was developed to investigate the protein interactome related to Aβ plaques. It was demonstrated that in human serum or human CSF, Aβ aggregates bound to a fluorescent probe can be detected and isolated using flow cytometry. Quantitative mass spectrometry analysis was performed on Aβ aggregates isolated from human CSF. The abundances and functional features of proteins found in the isolated aggregates were investigated, and a hypothetical model of the layered architecture of Aβ aggregates was proposed. 

In conclusion, this thesis describes the development of new concepts and methods that will hopefully contribute to increasing the understanding and improving the therapy of Alzheimer’s disease and other diseases associated with protein aggregation. 

Allt liv som vi känner till är till högsta grad beroende av proteiner. Proteiner utför nästan alla biologiska processer inom alla livsdomäner. Proteiner ger struktur till våra celler, transporterar syre i vårt blod, förser oss med energi genom att bryta ner socker och dessutom skyddar de oss från smittsamma sjukdomar, för att bara nämna några exempel. Proteiner består av kedjor av sammanlänkade aminosyror. De flesta proteiner består av ett unikt antal och en specifik ordning av 20 olika aminosyror. Aminosyrakedjorna veckas oftast till tredimensionella proteinstrukturer som gör att de kan utföra sina biologiska funktioner. Följaktligen kan det vara skadligt när veckningsprocessen går fel och proteiner inte antar deras funktionella struktur. Felveckade proteiner associeras med en rad olika sjukdomar. Ett sådant exempel är Alzheimers sjukdom, en irreversibel, progressiv hjärnsjukdom som gradvis leder till försämrat minne och mental förmåga. Psykiska och andra neurologiska symtom är även mycket vanliga och sjukdomen leder ofta till en för tidig död. I hjärnorna hos patienter med Alzheimers sjukdom bildas små klumpar, så kallade senila plack, som består av felveckade och aggregerade proteiner. Huvudbeståndsdelen i dessa klumpar är ett protein som kallas amyloid beta (Aβ).

Protein engineering beskriver processen att generera proteiner med förbättrade eller nya funktioner anpassade efter önskade egenskaper. Idag används såna proteiner inom olika områden, till exempel jordbruk- och livsmedelsindustri, diagnostik- och läkemedelsindustri och biobränsleproduktion. Affinitetsproteiner och proteaser är två typer av proteiner som har varit centrala för studierna i den här avhandlingen. Deras förmåga att specifikt binda till respektive klyva andra målproteiner har lett till en utbredd användning som bland annat forskningsreagens men även som molekyler för terapeutiska ändamål.

I studierna som ligger till grund för den här avhandlingen har amyloid beta dels använts som ett målprotein för att utveckla potentiella terapeutiska proteiner, men även som ett molekylärt verktyg för utveckling av nya metoder för protein engineering, och slutligen för att studera sammansättningen av patologiska proteinaggregat från Alzheimerpatienter.

Den första studien i denna avhandling beskriver utvecklingen av en ny metod för protein engineering för att effektivisera utvecklingen av aggregeringshämmare. Hämningen av Aβaggregering och följaktligen bildning av senila plack är en potentiell mekanism för att behandla Alzheimers sjukdom. I den andra studien konstruerades ett bioterapeutiskt kandidatprotein, som binder till Aβ, för att förbättra upptaget till centrala nervsystemet. Ökat läkemedelsupptag i centrala nervsystemet, platsen där amyloid beta aggregerar, har en stor sannolikhet att öka läkemedlets terapeutiska effekt. I den tredje studien utvecklades en ny metod för att generera proteinklyvande proteaser med förbättrade eller nya funktioner. Denna metod är baserad på aggregering av Aβ-peptiden och genererade ett antal nya proteasvarianter med förbättrad förmåga att klyva ett målprotein. I den fjärde studien användes samma metod för att generera proteasvarianter som klyver ett nytt målprotein som är väldigt likt Aβ. De nya varianterna har potential att vidareutvecklas till proteasbaserade läkemedelskandidater i framtiden. Den femte studien beskriver utvecklingen av en metod för att undersöka sammansättningen av tidigare nämnda senila plack. Den nya kunskapen om sammansättning av plack kan bidra till att förstå sjukdomens patologi, och utveckling av potentiella nya terapier.

Sammanfattningsvis så kommer resultaten som presenteras i denna avhandling förhoppningsvis att bidra till ökad förståelse och förbättrad behandling av Alzheimers sjukdom och andra sjukdomar som associeras med proteinaggregering.

Neurodegenerative disorders include a full spectrum of diagnoses, including dementias and other neuronal diseases, characterised by degradation of neurons in the brain occurring along with disease progression. Amongst the dementias, the most prevalent are Alzheimer’s (AD) and Parkinson’s disease (PD) that affect millions of people worldwide. During the last years, advancements in potential treatments have been made where the first two clinical antibodies have been approved by the US Food and Drug Administration (FDA) for a disease modifying effect on Alzheimer’s disease.

As alternatives to antibodies, other types of affinity reagents that are based on non-immunoglobulin protein scaffolds are also investigated. Such alternative scaffolds often demonstrate distinct and complementary properties compared to antibodies. In this thesis, the development of a new type of affinity protein scaffold called sequestrin is described. Sequestrins are derived from the affibody molecule and comprise two heterogenic subunits with truncated N-terminals fused as a head-to-tail construct. Sequestrins undergo a structural rearrangement upon target binding and forms a stabile complex. The scaffold is designed for interactions with disease-related amyloidogenic peptides e.g. amyloid beta and alpha-synuclein involved in AD and PD, respectively. In the first paper, a sequestrin library was developed and its compatibility with phage display was investigated. Successful panning against the amyloid beta peptide resulted in binders with high affinity. Further on in paper II, the alpha-synuclein peptide was targeted and sequestrins with low nanomolar affinities were obtained. All sequestrins displayed structural rearrangement upon target engagement, which stabilized the interaction to the target peptides and further inhibited toxic aggregation, opening up for future studies of disease modifying effects in vivo.

When targeting the brain, passage through the blood–brain barrier (BBB) is an obstacle that needs to be addressed to reach sufficiently high therapeutic concentrations. To overcome this barrier, brain shuttles have been developed with the capability to transport a cargo over the BBB. One such mechanism of transportation is by receptor-mediated transcytosis, which is utilized by e.g. the transferrin receptor (TfR). In paper III, a TfR-targeting shuttle was investigated for BBB passage when fused to a sequestrin targeting the amyloid beta peptide, resulting in a higher penetration through the BBB, and maintained functionality of the sequestrin.

High-throughput in vitro methods would facilitate development of novel brain shuttles. Thus, in paper IV, a transwell system based on nanofibrillar silkmembranes with murine brain endothelial cells was developed. Evaluation of the method using a TfR-specific antibody demonstrated higher transfer over the barrier compared to an isotype control and the method has potential to facilitate screening of transcytosis capability of brain shuttles.

In paper V, TfR-specific affibody-based brain shuttles were developed and investigated for transcytosis capability using the in vitro transcytosis assay. A panel of affibody molecules were evaluated, demonstrating both cross-species reactivity to murine and human TfR and active receptor-mediated transcytosis. These candidates could thus potentially be used in further development of CNS-targeting therapeutics.

In conclusion, a new sequestrin scaffold was developed that can be utilised for targeting amyloidogenic peptides found in neurodegenerative disorders. An affibody-based brain shuttle was also developed, which showed transcytosis capability. In the future, the new brain shuttle might be combined with sequestrins to create multifunctional fusion proteins for facilitated delivery over the BBB, which hopefully can result in therapeutic concentrations in the brain even when administered with a lower dosage.

Neurodegenerativa sjukdomar är en samlingsterm för olika tillstånd som bland annat inkluderar demenssjukdomar som Alzheimers och Parkinsons sjukdom, där hjärnans neuroner degraderas med sjukdomsutvecklingen. Miljontals personer är drabbade av dessa sjukdomar och tyvärr finns det få tillgängliga behandlingar. Nyligen har två antikroppar godkänts av amerikanska läkemedelsverket (the US Food and Drug Administration, FDA) som läkemedel för behandling av Alzheimers sjukdom, och dessa två är de första i sitt slag som påverkar sjukdomsförloppet.

I denna avhandling beskrivs utvecklingen av en ny typ av proteiner som kallas sequestriner, vilka är speciellt lämpade för bindning till aggregeringsbenägna amyloida proteiner som ofta kopplas till neurodegenerativa sjukdomar. Strukturen hos sequestrinerna undersöktes för möjligheten att binda samt blockera aggregering av amyloid beta och alfa-synuklein, proteiner som förekommer i Alzheimers samt Parkinsons sjukdom. Utvecklingen av ett nytt sequestrinbiblioteket och dess kompabilitet för användning i selektion med fag-display mot amyloid beta beskrivs i artikel I och mot alfa-synuklein i artikel II. Sequestrinerna som togs fram uppvisade hög bindningsstyrka samt inhiberade aggregering av målproteinerna. Transport av molekyler över blod–hjärnbarriären är strikt reglerad, varmed det behövs speciella transportörer för att nå hjärnan. Essentiella molekyler som inte når hjärnan via adsorption eller diffusion kan transporteras via receptor-medierad transcytos, till exempel via transferrinreceptorn (TfR) som normalt tar upp transferrin som binder till järn. I artikel III undersöktes en tidigare version av en sequestrin som binder amyloid beta för dess möjlighet att länkas till en TfR- medierad transportör för att komma över blod–hjärnbarriären. Fusionsproteinet visade en bibehållen funktionalitet och ett ökat upptag till cerebrospinalvätskan i hjärnan, sett för den variant med länkad TfR-transportör jämfört med sequestrin utan transportör.

För att kunna utvärdera aktiv transcytos utvecklades en metod för att utvärdera och ranka denna egenskap in vitro. Detta kan göras genom en ”transwell”-metod där ett nanofiber-membran av rekombinant spindelsilke används för att stödja tillväxten av hjärn-endotelceller. Med hjälp av fluorescens kan därav transcytos studeras och utvärderas. I artikel IV kunde en tidigare validerad TfR-transportör urskiljas från negativa kontrollen i denna metod.

I artikel V beskrivs arbetet med att utveckla ett antal varianter av affibodymolekyler med målet att fungera som transportörer via TfR för transport in till hjärnan. Dessa affibodymolekyler karakteriserades för sin funktion att binda till både humant och murint cellulärt uttryckt TfR. Vidare visades det att även andra generationens affibodymolekyler för TfR kunde genomgå transcytos över barriärmodellen.

Sammanfattningsvis presenteras det i denna avhandling en utveckling av sequestrinstrukturen och framtagande av nya bindare för inhibering av aggregationsprocessen hos proteiner som frekvent återfinns inom neurodegenerativa sjukdomar, samt utvecklingen utav affibody-transportörer över blod–hjärnbarriären.