Fluorescence microscopy is a powerful observation technique that allows researchers to visualize biological structures and processes within cells and tissues with high contrast. Development of fluorescence microscopy techniques is rapidly progressing, with increasing spatial and temporal resolution. The ability to observe live samples in three dimensions is particularly valuable as it enables studies of complex dynamic processes in whole organisms. 

In recent years several super-resolution microscopy techniques have been developed. Those techniques circumvent the physical diffraction limit for resolution and allow observation of finer details. However, these techniques are usually slower than their diffraction-limited counterparts. Multifocus microscopy is a widefield microscopy technique that enables simultaneous imaging of multiple focal planes and can be combined with super resolution microscopy. For the analysis of larger, up to cm-sized samples, light-sheet microscopy has arisen as a powerful technique offering improved axial contrast through optical sectioning and minimized phototoxicity due to its orthogonal illumination and detection geometry. For widefield techniques lacking optical sectioning capabilities, computational deconvolution can provide this functionality, provided there is an accurate characterization of the microscope’s point spread function (PSF), which describes how light propagates through the imaging system. 

This thesis describes contributions to the field by the development of advanced fluorescent microscopy techniques and computational post processing. In paper I, we constructed a multifocus structured illumination microscope (MF-SIM) with theoretical volumetric imaging speed of 7 Hz and lateral resolution of 105 nm. We demonstrate its capabilities by imaging endoplasmatic reticulum dynamics and microtubule dynamics. In paper II we constructed a 25-plane multifocus widefield microscope where each focus plane is captured by its own camera. We reach volumetric imaging speed of up to 125 Hz and show dynamics of living Drosophila larvae and C. elegans and apply deep learning methods to analyze the imaging data. In paper III we advanced the design of the open-source light-sheet microscope descSPIM for higher spatial resolution and image quality and show multicolor 3D imaging of kidney and lung tissue. In paper IV we apply a recently developed point spread function tool and provide experimental validation based on data from widefield imaging of fluorescent bead and C.elegans. 

Fluorescensmikroskopi är en kraftfull observationsteknik som gör det möjligt för forskare att visualisera biologiska strukturer och processer i celler och vävnader med hög kontrast. Utvecklingen av fluorescensmikroskopitekniker fortskrider snabbt, med ökande spatial och temporal upplösning. Möjligheten att observera levande prover i tre dimensioner är särskilt värdefull eftersom det gör det möjligt att studera komplexa dynamiska processer i hela organismer. 

Under de senaste åren har flera superupplösningsmikroskopitekniker utvecklats. Dessa tekniker kringgår den fysiska diffraktionsgränsen för upplösning och möjliggör observation av finare detaljer. Dessa tekniker är dock vanligtvis långsammare än diffraktionsbegränsade motsvarigheter. Multifokusmikroskopi är en ljusfältsmikroskopiteknik som möjliggör samtidig avbildning av flera fokalplan och kan kombineras med superupplösningsmikroskopi. För analys av större, upp till cm-stora prover, har light-sheetmikroskopi utvecklats till en kraftfull teknik som erbjuder förbättrad axiell kontrast genom optisk snittning och minimerad fototoxicitet tack vare dess ortogonala belysnings- och detektionsgeometri. För ljusfältsmikroskopi som saknar optisk snittningsförmåga kan avfaltning användas för att ändå ge denna funktionalitet. Detta förutsätter att det finns en noggrann karakterisering av mikroskopets punktspridningsfunktion (PSF), som beskriver hur ljus fortplantas genom avbildningssystemet. 

Denna avhandling beskriver bidrag till området genom utveckling av avancerade fluorescensmikroskopitekniker och databehandling. I artikel I konstruerade vi ett multifokus-strukturerad-belysningsmikroskop (MF-SIM) med en teoretisk volumetrisk avbildningshastighet på 7 Hz och lateral upplösning på 105 nm. Vi visar dess kapacitet genom att avbilda dynamiken i endoplasmatiskt retikulum och mikrotubuli. I artikel II konstruerade vi ett 25-plans multifokusmikroskop där de 25 fokusplanen registreras simultant på varsin kamera. Vi når en volumetrisk avbildningshastighet på 125 Hz och avbildar dynamiken hos levande Drosophila- larver och C. elegans samt anpassar djupinlärningsmetoder för analysen av bilddata. I artikel III avancerade vi designen av open-source light- sheetmikroskopet descSPIM för att nå högre spatial upplösning och bildkvalitet och visar flerfärgs 3D-avbildning av njur- och lungvävnad. I artikel IV gör vi analyser med ett nyligen utvecklat verktyg för punktspridningsfunktion och ger en experimentell validering med hjälp av data från ljusfältsmikroskopi av fluorescerande kulor och C. elegans.