Various approaches are used in fluorescence-based biological research to enhance the signal-to-background ratio (SBR). One general approach is to move to NIR wavelengths for excitation, where the background from cellular autofluorescence (AF) is minimal. The use of NIR fluorophores offers several additional advantages, including higher penetration depth and lower phototoxicity from lower photon energy. However, the low sensitivity of standard detectors in the NIR range is a major factor hindering the widespread use of NIR fluorophores. The low quantum yield and shorter lifetime of NIR fluorophores further exacerbate this challenge. Some detectors, like superconducting nanowire single-photon detectors (SNSPDs), are designed for improved operation in the NIR range. However, they are associated with significant costs. In Paper II, a dual-channel detection possibility with a single SNSPD was demonstrated to further add to their potential. Lock-in amplification is another commonly used method for enhancing the SBR. However, lock-in detection also amplifies any unintended laser light from scattering or reflection since it is modulated at the same reference frequency. Contributions from scattered laser light can introduce a significant background in tissue imaging where emission filters often cannot easily suppress this background. In Paper III, the nonlinear properties of lanthanide-doped upconversion nanoparticles (UCNPs) were exploited as frequency mixers to generate new frequency components, which could then be filtered out by a Fast Fourier Transform of the emission signal. Moreover, additional low-frequency beating signals could be generated by modulated excitation with more than one base modulation frequency. These results open for background-free imaging based on UCNPs and using low-speed detectors, including cameras. Although the two aforementioned studies focused on the advantages of excitation and detection within the NIR spectral range, thereby aiming to remove AF, the benefits of label-free studies based on AF itself should not be overlooked. The amino acid tyrosine is one of the abundant but dim sources of AF in the human body. Its emission can also contain valuable information about the local environment, particularly via its blinking properties reflecting its photophysical state transitions. This information has remained inaccessible by use of established methods such as fluorescence correlation spectroscopy (FCS). FCS analyses fluorescence intensity fluctuations from brightly fluorescent molecules in low concentrations and requires single-molecule detection (SMD) conditions, making FCS studies of dim tyrosine-containing molecules extremely difficult. Instead, the transient state (TRAST) monitoring technique can be used, allowing the exploration of their photophysics and extraction of related environmental information. TRAST, not requiring SMD conditions, provides the flexibility to be applied to dim samples where low fluorescence intensity signals can be compensated by increasing their concentration. In Paper I, TRAST measurements on tyrosine were demonstrated and applied to follow the conformational state of the tyrosine-containing protein Calmodulin. Exploiting AF is particularly valuable because it offers a label-free option, avoiding perturbations that may follow from fluorophore labeling. Yet, labeling with external fluorophores can also add further information to fluctuation-based methods, such as TRAST and FCS. In Paper IV, studying the co-enzyme Q₁₀ on fluorescein-labeled unilamellar vesicles allowed direct observation of proton exchange kinetics and of proton collecting antenna (PCA) effects of Q₁₀ in the vesicle membrane. In this case, although Q₁₀ is itself dimly AF, PCA effects were better observed through changes in protonation relaxation of the pH-sensitive fluorescein fluorophore label upon variation of the Q₁₀ concentrations in the vesicle membranes.

Inom fluorescensbaserad biologisk forskning används olika metoder för att förbättra signal/bakgrundsförhållandet (SBR). Ett allmänt tillvägagångssätt är att övergå till NIR-våglängder för excitation, där bakgrunden från cellulär autofluorescens (AF) är minimal. Användningen av NIR-fluoroforer ger flera ytterligare fördelar, bland annat högre penetrationsdjup och lägre fototoxicitet på grund av lägre fotonenergier. Den låga känsligheten hos standarddetektorer i NIR-området är dock en viktig faktor som hindrar en utbredd användning av NIR-fluoroforer. Det låga kvantutbytet och den kortare livslängden hos NIR-fluoroforer innebär ytterligare utmaningar. Vissa detektorer, t.ex. supraledande, med nanotrådsbaserade enfotondetektorer (SNSPD), är konstruerade för att fungera bättre i NIR-området. De är dock förknippade med betydande kostnader. I Paper II demonstrerades en möjlighet till tvåkanalsdetektering med en enda SNSPD för att ytterligare öka deras potential. Lock-in-förstärkning är en annan vanligt förekommande metod för att förbättra SBR. Lock-in-detektering förstärker dock även oavsiktligt laserljus från spridning eller reflektion eftersom det moduleras med samma referensfrekvens. Bidrag från spritt laserljus kan ge en betydande bakgrund vid vävnadsavbildning där emissionsfilter ofta inte enkelt kan undertrycka denna bakgrund. I Paper III utnyttjades de olinjära egenskaperna hos lantanid-dopade uppkonverteringsnanopartiklar (UCNPs) som frekvensblandare för att generera nya frekvenskomponenter, som sedan kunde filtreras fram genom en snabb Fourier-transformation av emissionssignalen. Dessutom kunde ytterligare lågfrekventa pulssignaler genereras genom modulerad excitation med mer än en basmoduleringsfrekvens. Dessa resultat öppnar för bakgrundsfri avbildning baserad på UCNPs och med hjälp av låghastighetsdetektorer, inkluderande även kameror. Även om de två ovannämnda studierna fokuserade på fördelarna med att excitera och detektera i NIR-spektralområdet och därmed ta bort AF, bör fördelarna med inmärkningsfria studier baserade på AF i sig inte förbises. Aminosyran tyrosin är en av de rikliga men svaga källorna till AF i människokroppen. Dess emissioner kan också innehålla värdefull information om den lokala miljön, särskilt via dess blinkande egenskaper som återspeglar dess fotofysiska tillståndsövergångar. Denna information har förblivit otillgänglig för etablerade metoder som fluorescens korrelationsspektroskopi (FCS). FCS analyserar fluktuationer i fluorescensintensitet från starkt fluorescerande molekyler i låga koncentrationer och kräver SMD-förhållanden (single-molecule detection), vilket gör FCS-studier av svaga tyrosininnehållande molekyler extremt svåra. Istället kan en teknik för att följa transienta tillstånd (TRAST) användas, vilken gör det möjligt att utforska dessa moleculers fotofysik och utvinna relaterad omgivningsinformation. TRAST, som inte kräver SMD-förhållanden, ger flexibiliteten att tillämpas på svagt emitterande prover där signaler med låg fluorescensintensitet kan kompenseras genom att öka deras koncentration. I Paper I demonstrerades TRAST-mätningar på tyrosin, vilka sedan tillämpades för att följa konformationstillståndet hos det tyrosininnehållande proteinet Calmodulin. Att utnyttja AF är särskilt värdefullt eftersom det erbjuder ett märkningsfritt alternativ, där man undviker störningar som kan uppstå till följd av fluoroformärkning. Märkning med externa fluoroforer kan dock också ge ytterligare information till fluktuationsbaserade metoder, som TRAST och FCS. I Paper IV möjliggjorde studier av co-enzymet Q₁₀ på fluoresceinmärkta unilamellära vesiklar direkt observation av protonutbyteskinetik och av PCA-effekter (proton collecting antenna) av Q₁₀ i vesikelmembranet. I det här fallet, även om Q₁₀ i sig är svagt AF, observerades PCA-effekter bättre genom förändringar i protoneringsrelaxationen hos den pH-känsliga fluorescein-fluoroforen vid variation av Q₁₀-koncentrationerna i vesikelmembranen.