Enzyme engineering is a powerful approach to enhancing biocatalytic performanceand optimizing protein-based materials for diverse applications. This study employsancestral sequence reconstruction (ASR), rational design, and process conditionoptimization to improve enzyme stability, catalytic efficiency, and functionalproperties. Four key areas are explored: transaminase engineering for chiral aminesynthesis, enzymatic amide bond formation, Baeyer-Villiger oxidation selectivitycontrol, and protein-based water-absorbing materials. To enhance thethermostability and substrate scope of ω-transaminase from Silicibacter pomeroyi(Sp-ATA), ASR was used to identify stabilizing mutations, improving its industrialsuitability. For amide bond formation, rational design optimized Pseudomonasaeruginosa N-acyltransferase (PaAT), coupled with the adenylation domain ofSegniliparus rugosus carboxylic acid reductase (CARsr-A). The engineeredY72S/F206N variant significantly enhanced conversion rates for pharmaceuticallyrelevant carboxylic acids, providing a sustainable alternative to chemical synthesis.In Baeyer-Villiger oxidation, process optimization was investigated to controlregioselectivity. Engineered Baeyer-Villiger monooxygenases (BVMOs) fromAcinetobacter and Arthrobacter species shifted product distribution toward the"normal" lactone by increasing oxygen availability. For protein-based waterabsorbingmaterials, patatin mutagenesis altered charged amino acid composition. As demonstrated by molecular dynamics simulations, variants enriched in Lys andAsp doubled water absorption, demonstrating the potential of enzyme engineering insustainable absorbent material development. This study integrates computationaland experimental enzyme engineering strategies to improve biocatalysis for chemicalsynthesis and functional biomaterials, offering novel solutions for industrialbiotechnology and sustainable material science.

Enzymingenjörskonst är en kraftfull strategi för att förbättra biokatalytisk prestanda och optimera proteinbaserade material för olika tillämpningar. Denna studie tillämpar rekonstitution av förfäderssekvenser (ASR), rationell design och optimering av processförhållanden för att förbättra enzymstabilitet, katalytisk effektivitet och funktionella egenskaper. Fyra centrala områden undersöks: transaminasdesign för syntes av kirala aminer, enzymatisk amidbildning, selektivitetskontroll vid Baeyer-Villiger-oxidation samt proteinbaserade vattenabsorberande material. För att förbättra termostabiliteten och substratspektra för ω-transaminaser från Silicibacter pomeroyi (Sp-ATA) användes ASR för att identifiera stabiliserande mutationer, vilket ökade enzymets industriella användbarhet. Vid amidbindningsbildning optimerades Pseudomonas aeruginosa N-acyltransferas (PaAT) genom rationell design och kombinerades med adenyleringsdomänen från Segniliparus rugosus karboxylsyrareduktas (CARsr-A). Den modifierade varianten Y72S/F206N visade en avsevärt förbättrad omvandlingshastighet för farmaceutiskt relevanta karboxylsyror, vilket erbjuder ett hållbart alternativ till kemisk syntes. I Baeyer-Villiger-oxidation undersöktes processoptimering för att styra regioselektiviteten. Ingenjörsmässigt modifierade Baeyer-Villiger monooxygenaser (BVMOs) från Acinetobacter- och Arthrobacter-arter kunde genom ökad syrgastillgänglighet styra produktfördelningen mot den "normala" laktonen. För proteinbaserade vattenabsorberande material genomfördes mutagenes på patatin, ett protein från potatis, för att förändra sammansättningen av laddade aminosyrarester. Varianter med en högre andel lysin och asparaginsyra uppvisade en fördubblad vattenabsorption, enligt molekylär dynamik-simuleringar, vilket demonstrerar potentialen hos enzymingenjörskonst för utveckling av hållbara absorberande material. Sammanfattningsvis belyser denna studieintegrationen av beräkningsbaserade och experimentella enzymteknikstrategier för att förbättra biokatalys vid kemisk syntes och för funktionella biomaterial, och erbjuder nya lösningar för industriell bioteknik och hållbar materialvetenskap.