Oomycete är en patogen eukaryota som påminner om svampar, men som egentligen är närmare besläktat med kiselalger och brunalger. De sprider växt- och djursjukdomar. Potatispest sprids av Phytophthora infestans och den årliga kostnaden ligger på 6,7 miljoner USD för att förebygga, behandla, utveckla resistenta växter, och bekosta förlorade skördar. Det påverkar konsumenters tillgång till föda och bönders försörjning. P. infestans, en typ av oomycete, är beroende av dess cellväggs förmåga att skydda den från växters immunförsvar, samt att kunna penetrera värdcellernas cellväggar för att komma åt näring för tillväxt och överlevnad. Proteiner från familjen GH72 (glykosidhydrolas 72) katalyserar förlängningen och förgreningen av 1,3-glukan i cellväggen på oomyceter. GH72 proteinerna känns igen på deras funktion och bevarade aminosyror. Utan GH72 proteiner förlorar cellväggen hållbarhet och integritet som den behöver för att växa normalt.

I detta projekt analyserades P. infestans glykosidhydrolas (D0NNQ7) in-silico för att bekräfta funktionalitet genom att studera dess proteinsekvens mot liknande proteiners, samt att identifiera bevarade aminosyror i det aktiva sätet genom modellering, och att konstruera ett 5 stamträd för att förstå dess relation till oomyceter och andra arter. Heterologt genuttryck av proteinet D0NNQ7 (beräknad storlek: 47 kDa) i jästsystemet Pichia pastoris utfördes för framtida karaktärisering för att undersöka dess potential som måltavla för en svampbekämpande pesticid.

Resultaten bekräftar många likheter mellan D0NNQ7 och proteiner inom GH72familjen, samt att de viktiga aminosyrorna Glu170/Glu270 är bevarade. Att uttrycka P. infestans D0NNQ7 heterologt i P. pastoris är fullt möjligt, och de optimala förhållandena observerades vara 1 % MetOH i BMMY-medium vid 30 °C i 48 timmar. Det finns dock problem med att försöka rena D0NNQ7 med his-trap rening. Stora mängder av ett okänt protein (35-40 kDa) som kontaminerar Ni-NTA agarosen. Fler experiment behöver utföras för att kunna förbättra reningsprocessen, eventuellt kan man utföra en direkt påföljande andra his-trap rening eller en gelfiltrering (size-exclusion chromatography).

Oomycetes are pathogenic eukaryotes similar to fungi, but closer related to diatoms and brown algae. They spread diseases amongst plants and animals. Late blight by Phytophthora infestans alone costs up to 6,7 million USD annually on prevention, fungicide usage, development of resistant plants and loss of crops. It affects consumers' food safety and farmers' livelihood. P. infestans, an oomycete, is dependent on a functioning cell wall to defend from plant immune systems and to penetrate the host cell walls to gather nutrition for growth and survival. Proteins from the GH72 (glycoside hydrolase 72) family catalyse the elongation and branching of 1,3-β-glucan in the cell walls of oomycetes. They are categorised by their function and conserved residues. Without GH72 proteins, the cell wall lacks strengths and integrity needed for growth.

In this project, the P. infestans glycoside hydrolase (D0NNQ7) was analysed in-silico to confirm functionality by studying its alignment to similar protein sequences, looking for its conserved residues in the active site by modelling, and to construct phylogenetic trees to understand how it relates to oomycetes and other species. Heterologous expression of D0NNQ7 (estimated size: 47 kDa) through the yeast expression system Pichia pastoris was performed for future characterisation to determine its potential as target for an antifungal pesticide.

The results confirm the many similarities D0NNQ7 has to GH72 family and the conservation of the residues Glu170/Glu270. Heterologous expression of P. infestans D0NNQ7 in P. pastoris is possible and the optimal conditions for expression was observed to be 1% MetOH BMMY at 30 °C for 48 h. However, purification by his-trap is problematic due to large quantities of a unknown contamination of size 35-40 kDa. More experimentation to improve purification is needed, possibly by a second his-trap purification or size-exclusion chromatography.