This thesis introduces new ways to produce micro-and nanostructures of recombinant spider silk and explores ways to characterize their topography, mechanical properties, cell compatibility, and permeability. The suitability of the formed structures for applications within tissue engineering, primarily in vitro tissue modeling, is also investigated.

One big challenge in drug development is that many drug candidates fail to pass in vivo studies in humans. This is largely because the currently used animal models fail to emulate the full human condition. Therefore, researchers aim to develop in vitro models of various tissues using human cells. These new systems will allow studies of biological responses and mechanisms related to human health and disease. To accurately represent what happens in the body, the materials used for cell culture should as closely as possible mimic their in vivo counterparts. Many of the materials used today are made out of plastic and lack physiologically relevant properties, and do not replicate the micro-and nano dimensions present in the native cell environment.

Spider silk has been suggested as a suitable replacement material for cell culture. The usage of spider silk for medical purposes is not new; it was used already in ancient Greece and Rome to staunch wounds. However, the spider's limited production has haltered the applicability. Lately, new doors have opened up through recombinant production of the base constituent of silk: the spider silk protein (spidroin). Recombinant spidroin production is not only scalable but also allows for facile integration of additional biofunctionality. With this building material at hand, it is possible to produce other formats than spider silk fibers, i.e., coatings, films, membranes, hydrogels, porous scaffolds, and microparticles. 

With the work presented in this thesis, the list is extended through the introduction of new methods to produce nanomembranes and uniformly shaped micro-and nanostructures by manipulating the liquid:air interface. Micropatterned mm-sized films, microfilms, nanochains, and nanowires were produced by manipulating a droplet of soluble spidroin solution on a superhydrophobic surface. Alterations in the concentration of spidroins, the motion of the droplet, and the dimensions of the pillars allow for precise control of the silk formation. The formed silk structures retained their shape upon release from the surface, and the culture of mammalian cells showed good compatibility with the silk structures. Nanofibrillar spider silk membranes mimicking the dimensions of basal membranes  (280 nm thick) were formed by letting spidroins self-assemble at the liquid:air interface of a standing solution. The assembly time, initial spidroin concentration, and beaker size are directly related to the membrane's thickness and size. The thereby obtained membranes were stable, had an internal nanofibrillar structure, could stretch over 200%, and were permeable to human plasma proteins. An in vitro blood vessel model was established by growing human endothelial cells and smooth muscle cells on opposing sides of the membrane, showing the potential of using the membranes for further in vitro modeling

Den här avhandling introducerar nya sätt att producera mikro- och nanostrukturer av rekombinant spindelsilke och utforskar sätt att karakterisera deras topografi, mekaniska egenskaper, cellkompatibilitet och permeabilitet. Lämpligheten hos de formade strukturerna för applikationer inom vävnadsteknik, främst för in vitro vävnadsmodellering, undersöks också.

En stor utmaning i läkemedelsutveckling är att många kandidater inte uppvisar önskad effekt i in vivo studier i människor. Detta beror till stor del på att de djurmodeller som används i den primära utvärderingen inte efterliknar den mänskliga kroppen tillräckligt bra.  På grund av detta har forskare börjat utveckla metoder för att använda mänskliga celler i in vitro modeller av olika vävnader. Dessa nya system öppnar upp för möjligheten att studera biologiska reaktioner och mekanismer relaterade till människors hälsa. För att korrekt kunna modellera vad som händer i kroppen bör materialen som används för cellodling så nära som möjligt efterlikna deras motsvarigheter in vivo. Många av de material som används idag är gjorda av plast, saknar fysiologiskt relevanta egenskaper och replikerar inte de mikro- och nanodimensioner som finns i cellmiljön i kroppen.

Spindelsilke har föreslagits som ett lämpligt material för cellodling. Användningen av spindelsilke för medicinska ändamål är inte ny, utan det användes redan i det antika Grekland och Rom för att stoppa blödningar. Användbarheten begränsas dock av att spindlar enbart producerar en liten mängd silke. På senare tid har nya dörrar öppnats genom rekombinant produktion av baskomponenten i silket: spindelsilksproteiner (spidroiner). Rekombinant produktion as spidroiner är inte bara skalbar utan möjliggör också enkel integration av biofunktionalitet. Med byggmaterialet till hands är det även möjligt att producera fler format än enbart spindelsilkesfibrer, dvs. beläggningar, filmer, membran, hydrogeler, porösa strukturer och mikropartiklar.

Arbetet som presenteras i den här avhandlingen fyller på listan genom att introducera nya metoder för att producera nanomembran och enhetligt formade mikro- och nanostrukturer genom att manipulera vätske:luftgränssnittet. Mikromönstrade mm-filmer, mikrofilmer, nanokedjor och nanotrådar producerades genom att manipulera en droppe spidroinlösning på en superhydrofob yta. Förändringar i spidroinernas koncentrationen, droppens rörelse och dimensionerna på pelarna möjliggör exakt kontroll av silkeformationen. De formade silkestrukturerna behöll sin form efter frisättning från ytan, och odlingen av mänskliga celler visade god kompatibilitet med silkesstrukturerna. 280 nm tjocka nanofibrillära spindelsilkesmembran, som imiterar dimensionerna hos basala membran, bildades genom att låta spidroiner självinteragera vid vätske:luftgränssnittet i en stillastående lösning. Tid, initial spidroinkoncentration och bägardimensioner är direkt relaterade till membranets tjocklek och storlek. Nanomembranen formade via denna metod var stabila, kunde sträcks över 200% och var permeabla för mänskliga plasmaproteiner. En in vitro-blodkärlsmodell upprättades genom att växa humana endotelceller och glatta muskelceller på motsatta sidor av membranet, vilket påvisar potentialen att använda membranen för vidare in vitro modellering.

Spider silk is a natural protein-based material known for its medicinal use and remarkable mechanical properties. Structures made thereof are both strong and elastic and have been shown to be favorable matrices for tissue engineering. As natural spider silk is difficult to obtain, recombinant technology is instead used to produce partial silk proteins. This thesis investigates the use of one such partial spider silk protein functionalized with a cell adhesion motif from fibronectin, FN-4RepCT, to coat the surface of synthetic polymers, as well as self-assemble into nanofibrillar membranes for modelling of tissues in vitro.

In Paper I, the silk protein was shown to self-assemble into coatings with simultaneous entrapment of cells (co-seeding) to functionalize polymeric surfaces. The results showed that the co-seeding approach facilitated the adherence and sustained the viability of cells on surfaces of materials widely used for the manufacture of cardiovascular grafts.

In Paper II, a protocol was developed to enable the formation of nanofibrillar coatings on the surface of membranes intended for guided bone regeneration. This was done by reducing the surface tension of the membranes, allowing for the self-assembly of silk proteins to take place. The silk coating facilitated the adherence, promoted the growth, and mediated the generation of a cell monolayer of tissue representative cells seeded on either side of the membrane.

In Paper III, the self-assembly of the silk protein at the air-liquid interface was shown to form cm-sized free-standing, tough and elastic, nanofibrillar silk nanomembranes, permeable to macromolecules of various sizes, and able to support the establishment of a confluent layer of keratinocytes seeded on either side. In Paper IV, the nanofibrillar silk membranes were shown able to support cell co-culture to generate a model of the blood vessel wall in vitro.

In Paper V, an alveolar-capillary model was established by seeding lung epithelial and endothelial cells on opposite sides of nanofibrillar silk membranes. The results showed the formation of an in vivo like tissue through the expression of junctional complexes and the production of essential surfactants. The silk membranes were also for the first time integrated into a microfluidic device to expose the endothelium to flow-induced shear stresses.

Altogether, the work conducted in this thesis shows promise to the use of the FN-4RepCT silk protein both for coating surfaces of bio-inert synthetic polymeric materials and forming thin and nanofibrillar membranes for the engineering of tissues in vitro.

Spindelsilke är ett naturligt proteinbaserat material som är välkänt för sin medicinska användning och sina anmärkningsvärda mekaniska egenskaper. Strukturer gjorda därav är både starka och elastiska och har visat sig vara lämpliga matriser för vävnadsteknik. Eftersom det naturliga spindelsilket är svårt att få tag på, används i stället rekombinationsteknologi för att producera partiella silkesproteiner. Denna avhandling undersöker användningen av ett sådant partiellt spindelsilkeprotein som har funktionaliserats med ett celladhesionsmotiv från fibronektin, FN-4RepCT, för att belägga ytor på syntetiska polymerer, samt forma nanofibrillära membran för modellering av vävnader in vitro.

I Artikel I visades att silkesproteinet, tillsammans med celler, spontant formar en beläggning på ytan av olika polymerer, och därmed kan användas för att funktionalisera dessa. Resultaten visade att samformuleringsmetoden underlättar eller t.o.m. möjliggör adhesion av cellerna till ytan, samt bibehåller cellernas viabilitet på material som vanligen används i kardiovaskulära transplantat.

I Artikel II utvecklades ett protokoll för att minska ytspänningen hos membran som är avsedda för att styra benregenerering. Detta för att möjliggöra för silkesproteiner att forma nanofibrillära silkesbeläggningar på denna typ av material. Silkesbeläggningen underlättade adhesion av cellerna, och befrämjade deras tillväxt så att monolager av vävnadsrepresentativa celler kunde bildas på vardera sidan av membranet.

I Artikel III visas det att silkesproteinet spontant bildar cm-stora fristående, starka och elastiska silkesnanomembran vid gränssnittet mellan luft och vätska. Molekyler av olika storlekar kan passera genom membranen, som även främjar etableringen av ett konfluent monolager av keratinocyter sådda på båda sidorna av membranet.

I Artikel IV påvisas det att dessa silkesmembran kan användas för samodling av två celltyper och på så sätt skapa en in vitro modell av blodkärlsväggen.

I Artikel V etablerades en alveolär-kapillär in vitro modell genom att odla lungepitel- och endotelceller på motsatta sidor av nanofibrillära silkesmembran. Cellerna hade speciella strukturer på sin yta som förankrade dem med varandra, och producerade även essentiella yt-surfaktanter, vilket sammantaget visade att en in vivo-liknande vävnad hade bildats. Silkesmembranen integrerades också i ett mikroflödes-chip, något som aldrig tidigare genomförts, för att kunna exponera endotelet för flödesinducerade skjuvkrafter.

Sammantaget visar arbetet som utförts i denna avhandling att silkesproteinet FN-4RepCT är lovande för att belägga bioinerta ytor av syntetiska polymerer, samt för att bilda tunna, nanofibrillära membran för konstruktion av vävnader in vitro.