Duchenne muscular dystrophy (DMD) and Becker muscular dystrophy (BMD) are two rare genetic disorders of the family dystrophinopathy. They are both caused by the lack of, or reduced production of, the protein dystrophin. Due to abnormal dystrophin expression, patients experience progressive loss of muscle mass and cardio-, respiratory- and sometimes cognitive complications. DMD is the more severe form of dystrophinopathy, which manifests in young children and leads to wheelchair confinement in early teens followed by bed confinement and a shortened life expectancy. Dystrophin expression is absent or at less than 3% in DMD patients, often due to frame-shift mutations which cause protein expression to stop pre-maturely. BMD patients, on the other hand, display a higher but variable expression of dystrophin, often with large internal truncations. This partial expression results in a milder phenotype than DMD with sometimes unaffected life expectancies compared to healthy individuals. In the past decade, there has been substantial research into therapies aiming at increasing dystrophin expression in DMD patients and thereby prolonging ambulation, with the first gene-therapy gaining regulatory approval from the U.S. Food and Drug Administration (FDA) in June 2023. Current regulatory approvals for treatments of DMD patients have relied on dystrophin quantification in muscle biopsies as a biomarker and surrogate endpoint to predict a possible benefit from treatment, but these tests require repeated collection of muscle biopsies. 

Biomarkers are biochemical or physiological laboratory tests that measure a biological processes or condition. There is a need for monitoring biomarkers in dystrophinopathies, as well as biomarkers which can be used to predict outcome in clinical trials. As patients are often young children, it is important to develop biomarkers from less invasive and more readily available biological samples than muscle biopsies, such as blood or urine.

In this thesis, we have used affinity proteomics and mass spectrometry to identify and validate biomarkers for monitoring disease progression in DMD and BMD patients from serum or plasma. The overall aim has been to identify biomarkers capable of distinguishing between patients with different levels of dystrophin expression and rates of disease progression in order to suggest gene-therapy pharmacodynamic biomarkers. In Paper I, we used suspension bead array (SBA) technology to identify biomarker candidates which reflect disease progression in DMD. Ten proteins were identified as related to disease progression. The ten biomarker candidates identified in Paper I were further analytically validated in Paper II using two orthogonal and absolute quantitative methods, parallel reaction monitoring mass spectrometry (PRM-MS) and sandwich immunoassays, which resulted in five analytically validated disease monitoring biomarkers for DMD (CA3, MYL3, LDHB, COL1A1 and FGG).

Dystrophin-restoring therapies build on the hypothesis that increasing expression of internally deleted dystrophin reduces disease severity. In BMD patients, partial expression of short dystrophin molecules results in a milder phenotype than in DMD patients lacking expression of dystrophin. However, there are some differences in the nature of disease progression between DMD and BMD. In Paper III, we used Data Independent Acquisition Mass Spectrometry (DIA-MS) to study proteomic similarities and differences between DMD and BMD disease progression. This study revealed some discrepancies between disease progression biomarker candidates in the two related disorders.

In Paper IV, we searched for blood biomarkers capable of reflecting changes in dystrophin expression during gene-therapy clinical trials. We identified ten proteins which correlated with dystrophin or microdystrophin expression in DMD mouse models. Out of these ten proteins, we identified that myosin light chain 3 (MYL3) declined steeper over time in dystrophinopathy patients with low or no dystrophin expression compared to patients with higher dystrophin expression. Two more biomarkers were identified in Paper IV as potentially related to dystrophin expression in muscle biopsies from both mouse models and patients. These were titin (TTN) and, interestingly, serum leakage of dystrophin. 

The possible presence of dystrophin in blood has not been well studied, and only one prior publication suggests that dystrophin may be a biomarker for DMD. Many DMD therapies currently in clinical trials aims at restoring dystrophin production and for those trials, the possibility of monitoring dystrophin leakage into blood could provide valuable information on therapeutic efficacy. In Paper V, we designed a proof-of-principle study to explore if dystrophin in blood can be a DMD biomarker. 

In conclusion, this thesis explores disease progression monitoring biomarkers and gene-therapy pharmacodynamic biomarkers for DMD and BMD. Three proteins, MYL3, TTN, and serum levels of dystrophin, are here suggested as possible gene-therapy pharmacodynamic biomarkers. 

Duchenne muskeldystrofi (DMD) och Becker muskeldystrofi (BMD) är två ovanliga, genetiska sjukdomar som går under samlingsnamnet dystrofinopatier. Dystrofinopatier orsakas av att proteinet dystrofin antingen saknas helt eller uttrycks vid längre koncentration i muskler och hjärta än normalt. På grund utav onormalt dystrofinsyntes så förlorar patienter muskelmassa över tid samt upplever påverkan på hjärta och lungor. Ibland har patienter även nedsatt kognitiv förmåga. DMD är den allvarligare formen av dystrofinopati. De första symptomen märks redan i små barn och leder till förlorad förmåga att gå i yngre tonåren samt förkortad livslängd. I DMD uttrycks dystrofin i mindre än 3% än uttrycket i friska muskler, oftast som följd av mutationer som orsakar tidigt avslut av proteinsyntes (s.k. ramförskjutningsmutationer). BMD-patienter, å andra sidan, har ett något högre men variabelt uttryck av dystrofin jämfört med DMD och ofta i kombination med stora interna deletioner. Detta reducerade uttryck av dystrofin resulterar i en mildare fenotyp än DMD. Under det senaste decenniet har forskare fokuserat på att utveckla behandlingsmetoder som kan öka uttrycket av dystrofin i DMD-patienter och därmed förlänga patienternas livslängd samt även förlänga tiden då patienten kan gå självständigt. Den första genterapin för DMD godkändes av USA:s läkemedelsmyndighet Food and Drug Administration (FDA) i juni 2023, men saknar än så länge myndighetsgodkännande i Europa. Myndighetsgodkännanden för behandlingar av DMD har i flera fall baserats på att ett ökat inducerat dystrofinuttryck observerats i muskelbiopsier efter behandling, vilket enligt FDA sannolikt tyder på en klinisk fördel från behandlingen. Dessa tester kräver dock att patienten donerar upprepade muskelbiopsier. Dystrofinuttryck i muskel används här som en s.k. biomarkör. 

Biomarkörer är biokemiska eller fysiologiska laborativa tester som mäter en biologisk process eller tillstånd. Det finns idag ett behov av nya biomarkörer för att följa sjukdomsförlopp i dystrofinopatier samt biomarkörer som kan användas till att förutsäga utfall i kliniska studier. Eftersom denna patientgrupp ofta består av unga individer så är det viktigt att utveckla nya biomarkörer från mindre invasiva prov-material än muskelbiopsier, så som blod eller urin.

I denna avhandling så har vi använt oss utav affinitetsproteomik samt masspektrometri för att identifiera och validera blodbiomarkörer för DMD och BMD. Det övergripande målet har varit att identifiera biomarkörer med förmågan att särskilja patienter med olika nivåer av både dystrofinuttruck samt progression, för att senare kunna identifiera biomarkörer för att övervaka effekt av genterapier i DMD. I Artikel I använde vi oss utav en så kallad ”suspension bead array” (SBA)-teknologi för att identifiera biomarkörskandidater för sjukdomsprogression i DMD. Vi identifierade tio proteiner relaterade till progression. Analytisk validering av dessa tio biomarkörskandidater genomfördes i Artikel II med hjälp av två ortogonala, absolutkvantitativa metoder, ”Parallell Reaction Monitoring” masspektrometri (PRM-MS) samt ”sandwich immunoassay”. Detta resulterade i analytisk validering av fem biomarkörer för att följa sjukdomsutveckling i DMD (CA3, MYL3, LDHB, COL1A1 samt FGG).

Även om både DMD och BMD orsakas av mutationer i samma gen, så finns det skillnader i både sjukdomsprogression och symptom mellan de två patientgrupperna. I Artikel III använde vi masspektrometri för att studera skillnader och likheter i blodproteomet mellan DMD och BMD över tid, vilket visade på diskrepanser i vilka biomarkörskandidater som är lämpliga för att följa sjukdomsprogression i dessa två sjukdomar.

I Artikel IV letade vi efter blodbiomarkörer med förmågan att reflektera förändrat dystrofinuttryck i kliniska studier för genterapier. Vi identifierade tio proteiner som korrelerade med dystrofin- samt mikrodystrofinuttryck i plasma från en DMD-musmodell behandlad med en mikrodystrofinterapi. Av dessa tio proteiner konstaterade vi att myosin lätt kedja 3 (MYL3) minskar snabbare över tid i serum från dystrofinopati-patienter med lågts eller inget dystrofinuttryck än i patienter med högre uttryck. Två ytterligare proteiner, titin (TTN) och serum-läckage av dystrofin, var associerade med dystrofinuttryck i muskler.  

Endast en tidigare publikation påvisar att dystrofin kan vara en blodbiomarkör för DMD. Då många terapier för DMD i kliniska studier har som syfte att öka dystrofinuttrycket så skulle möjligheten att detektera läckage av dystrofin i blod kunna bidra med värdefull information om terapeutisk effekt. I Artikel V designade vi därför en ”proof of principle”-studie för att utforska om dystrofin kan detekteras i blod och i så fall om det kan utgöra en rimlig biomarkörskandidat.

Sammanfattningsvis utforskar denna avhandling biomarkörer för att följa sjukdomsförlopp och utvärdera genterapier i DMD och BMD. Från våra resultat föreslår vi tre biomarkörskandidater: MYL3, TTN samt dystrofin i serum.