X-ray fluorescence imaging (XFI) is an emerging technique for preclinical studies, characterized by high resolution, specificity, and sensitivity. It relies on nanoparticles (NPs) as contrast agents, which must be constituted of specific elements that match the X-ray source energy for detection. Laboratory liquid metal-jet X-ray sources enable compact in vivo XFI, thereby extending the accessibility of this imaging technique beyond synchrotron facilities.

When designing NPs as contrast agents, biocompatibility is essential for both preclinical and clinical imaging, often requiring a passivating biocompatible coating on the NP surface. The NP cores can provide contrast by their elemental composition, while coating, conjugation, and decoration strategies can add other functionalities and improve biocompatibility.

In this thesis, multifunctional NPs are designed to extend the functionality of XFI contrast agents by incorporating optically fluorescent or magnetically active components: conjugated carbon quantum dots, dye-doped silica shell, and decorated superparamagnetic iron oxide NPs. The designed multifunctional NPs allow correlative and multiscale imaging with complementary techniques such as confocal optical microscopy or magnetic resonance imaging (MRI). Furthermore, these NPs also facilitate more comprehensive studies on NP pharmacokinetics, paving the way for more robust investigations in the field of nanomedicine.

The benefits of multifunctional NPs are demonstrated with two approaches. First, in vivo correlative imaging with MRI and XFI is shown to reduce false positives caused by MRI artifacts in the lungs and abdomen. Second, XFI is employed to enable rapid NP bioengineering, by iteratively improving NP properties and administration strategies for passive tumor targeting. Optical and X-ray fluorescent multifunctional NPs enable the co-localization of NPs at both macroscopic and microscopic levels with XFI and confocal microscopy, correlating NP accumulation in organs with NP-cell interactions. These results highlight the role of XFI in the field of nanomedicine, with potential applications in pharmacokinetics, tumor targeting, treatment monitoring, and the development of medical devices.

Röntgenfluorescensavbildning (RFA) är en växande teknik för prekliniska studier, och karakteriseras av hög upplösning, specificitet och känslighet. RFA använder nanopartiklar (NP:ar) som kontrastmedel, vilket måste innehålla specifika element som matchar röntgenkällans energi. Röntgenkällor med flytande metallstråleteknik möjliggör kompakt in vivo RFA i laboratorier, vilket gör denna avbildningsteknik tillgänglig även utanför synkrotronanläggningar.

Vid utformningen av NP:ar som kontrastmedel är biokompatibilitet avgörande betydelse både för preklinisk och klinisk avbildning, vilket ofta kräver ett passiverande biokompatibelt skikt på NP-ytan. NP-kärnorna kan ge kontrast genom sin grundämnessammansättning, medan beläggnings-, konjugerings- och dekorationsstrategier kan lägga till andra funktionaliteter och förbättra biokompatibiliteten.

I denna avhandling syntetiseras multifunktionella NP:ar för att utöka funktionaliteten hos RFA-kontrastmedel genom att inkorporera optiskt fluorescerande eller magnetiskt aktiva komponenter: konjugerade kolkvantprickar, färgämnesdopat  kiseldioxidskal och dekorerade superparamagnetiska järnoxid NP:ar. De utformade multifunktionella NP:arna möjliggör korrelativ avbildning med kompletterande tekniker som konfokal optisk mikroskopi eller magnetisk resonanstomografi (MR). Dessutom underlättar dessa NP:ar också mer omfattande studier av NP-farmakokinetik, vilket banar väg för bättre underbyggda undersökningar inom nanomedicin.

Fördelarna med multifunktionella NP:ar demonstreras med två tillvägagångssätt. För det första har in vivo korrelativ avbildning med MR och RFA visat sig minska antalet falska positiva resultat orsakade av MR-artefakter i lungorna och buken. För det andra används RFA för att möjliggöra snabb utveckling och design av NP:ar, genom att iterativt förbättra NP-egenskaper och administreringsstrategier för passiv ansamling i tumörer. Optiska och röntgenfluorescerande multifunktionella NP:ar möjliggör samlokalisering av NP:ar på både makroskopisk och mikroskopisk nivå med RFA och konfokal mikroskopi, vilket korrelerar NP-ackumuleringar i organ med NP-cellinteraktioner. Dessa resultat belyser RFA:s roll inom nanomedicinfältet, med dess potentiella tillämpningar inom farmakokinetik, tumörmålsökning, behandlingsövervakning och utveckling av medicinska instrument.

Soft x-ray microscopy within the water window is a powerful technique for high-resolution biological imaging due to its capability to image whole, intact cells (approximately 10 μm thick) in their near-native cellular environment. The short wavelength of water-window radiation (λ = 2.3 − 4.4 nm, E = 284−540 eV) used in this imaging technique provides high natural contrast for cellular imaging due to the significant difference in soft x-ray attenuation lengths between organic materials, such as proteins and lipids (i.e., carbon), and water (i.e., oxygen). In addition to the high imaging contrast, the high penetration of soft x-rays eliminates the need for laborious sample preparation, including sectioning, chemical fixation, heavy-metal staining, and fluorescence labeling. The majority of soft x-ray microscopes are operated using synchrotron radiation sources, as they require x-ray sources with high spectral brightness, which limits accessibility. To complement these synchrotron-based instruments, we develop a laboratory-based soft x-ray microscope as alternative system for biological imaging. Motivated by this background, this thesis presents the development of laboratory soft x-ray microscopy focused on improving image resolution and optimizing sample preparation. The resolution has been improved to 25 nm(half-period) through vibration analysis and mitigation. Sample preparation optimization was achieved by controlling the ice thickness during devitrification process, applied to both manual plunge-freezing and automated systems, allowing for the preservation of cellular structures and improved image quality. These developments have enabled the establishment of methodology for investigating nanoparticle interactions in-vitro and in-vivo, relying solely on x-ray imaging. These advancements have enabled the investigation of uptake and dynamics of nanoparticles in organelles. Moreover, the applications extend beyond bio-nano interactions; they have also facilitated quantitative studies in viral infections of giant DNA viruses.

Mjukröntgenmikroskopi inom vattenfönstret är en kraftfull teknik för hög-upplöst biologisk avbildning tack vare dess förmåga att avbilda hela, intakta celler (ungefär 10 μm tjocka) i deras nära naturliga cellulära miljö. Den korta våglängden hos strålning i vattenfönstret (λ = 2.3–4.4 nm, E = 284–540 eV) som används i denna avbildningsteknik ger hög naturlig kontrast för cellulär avbildning, tack vare den betydande skillnaden i mjukröntgens absorptionslängd mellan organiska material, såsom proteiner och lipider (dvs. kol), och vatten (dvs. syre). Förutom den höga bildkontrasten eliminerar den höga penetrationen av mjukröntgen behovet av tidskrävande provberedning, inklusive sektionering, kemisk fixering, tungmetallfärgning och fluorescensmärkning. De flesta mjukröntgenmikroskop finns hos synkrotronstrålningskällor eftersom de kräver röntgenkällor med hög spektral ljusstyrka, vilket begränsar tillgängligheten. För att komplettera dessa synkrotronbaserade instrument utvecklar vi ett laboratoriebaserat mjukröntgenmikros-kop som ett alternativt system för biologisk avbildning. Motiverad av denna bakgrund presenterar denna avhandling utvecklingen av laboratoriebaserad mjukröntgenmikroskopi med fokus på att förbät-tra bildupplösningen och optimera provberedningen. Upplösningen har förbättrats till 25 nm (halvperiod) genom vibrationsanalys och dämpning. Optimering av provberedning uppnåddes genom att kontrollera istjockleken under vitrifieringsprocessen, tillämpad både vid manuell snabbfrysning och automatiserade system, vilket möjliggjorde bevarandet av cellstrukturer och förbättrad bildkvalitet. Dessa utvecklingar har möjliggjort etableringen av en metodik för att undersöka nanopartikelinteraktioner in vitro och in vivo, enbart med hjälp av röntgenavbildning. Framstegen har också möjliggjort undersökning av upptag och dynamik av nanopartiklar i organeller. Dessutom sträcker sig tillämpningarna bortom bio-nano-interaktioner; de har också underlättat kvantitativa studier av virusinfektioner med gigantisk DNA-virus.