Change search
CiteExportLink to record
Permanent link

Direct link
Cite
Citation style
  • apa
  • harvard1
  • ieee
  • modern-language-association-8th-edition
  • vancouver
  • Other style
More styles
Language
  • de-DE
  • en-GB
  • en-US
  • fi-FI
  • nn-NO
  • nn-NB
  • sv-SE
  • Other locale
More languages
Output format
  • html
  • text
  • asciidoc
  • rtf
A new silk protein designed for improved functionalization using Sortase A coupling
KTH, School of Engineering Sciences in Chemistry, Biotechnology and Health (CBH).
2018 (English)Independent thesis Advanced level (degree of Master (Two Years)), 20 credits / 30 HE creditsStudent thesis
Abstract [en]

The partial spider silk protein 4RepCT have been functionalized with a range of functional domains using a genetic fusion method. An important complementary method to genetic fusion is Sortase A coupling. The use of enzymatic coupling enables to add functions to silk that cannot be expressed efficiently as a fusion protein with 4RepCT. To increase the yield and the rate of the Sortase A coupling, previous studies suggest an increase in the number of glycine residues on the N-terminal of the nucleophile in the reaction. The aim of the degree project was to design, produce and analyze a new silk protein, G5-4RepCT, for improved Sortase A coupling. The silk protein was cloned, expressed in E. coli cells and purified with Immobilized metal affinity chromatography (IMAC). The IgG binding affinity domain Z was coupled to G5-4RepCT coatings and G5-4RepCT in solution. The amount of coupled product (Z-G5-4RepCT) was estimated on the coatings using an IgG-fluorophore. The amount and rate of product formation were analyzed in solution using SDS-PAGE. The G5-4RepCT silk protein was compared to wildtype silk (GP-4RepCT) and a silk protein with an interruptive proline in the N-terminal glycine sequence (GP-G3-4RepCT). The results show most coupled product for the G5-4RepCT silk coatings, and most product at the fastest rate when coupling to G5-4RepCT in solution. The findings correlate with previous studies and implies an improved Sortase A coupling with an increased number of N-terminal glycines on the 4RepCT silk.

Abstract [sv]

Det partiella spindelsilkesproteinet 4RepCT har funktionaliserats med en rad olika funktionella domäner med hjälp av genetisk fusion. En viktig kompletterande metod till genetisk fusion är Sortase A-koppling. Genom att använda enzymatisk koppling, kan även funktioner som inte är möjliga att uttrycka effektivt som fusions proteiner med 4RepCT, adderas till silke. För att öka utbytet och hastigheten av Sortase A-koppling, föreslås i tidigare studier att öka antalet N-terminala glycinaminosyror på nukleofilen i reaktionen. Målet med examensarbetet var att designa, producera och analysera ett nytt silkesprotein, G5-4RepCT, för en förbättrad Sortase A-koppling.  Silkesproteinet klonades, uttrycktes i E. coli-celler och renades fram med Immobiliserad affinitetsmetall kromatografi (IMAC). Den IgG-bindande affinitetsdomänen Z kopplades till ytbeläggningar av G5-4RepCT samt till G5-4RepCT i lösning. Mängden kopplad produkt (Z-G5-4RepCT) uppskattades på ytbeläggningarna med hjälp av en IgG-fluorofor. Mängden och hastigheten av produktbildandet analyserades i lösning genom att använda SDS-PAGE. G5-4RepCT silkesproteinet jämfördes med ”vildtyp-silke” (GP-4RepCT) och ett silkesprotein med en avbrytande prolin i den N-terminala glycinsekvensen (GP-G3-4RepCT). Resultaten påvisar mest kopplad produkt för ytbeläggningarna av G5-4RepCT, och mest produkt vid snabbast hastighet för G5-4RepCT vid koppling i lösning.  Iakttagelserna korrelerar med tidigare studier, och implicerar en förbättrad Sortase A-koppling med ett ökat antal N-terminala glycinaminosyror på 4RepCT silke.

Place, publisher, year, edition, pages
2018.
Keywords [en]
Partial spider silk, functionalization, Sortase A coupling, silk coatings, Enterokinase
Keywords [sv]
Partiellt spindelsilke, funktionalisering, Sortase A-koppling, silkes-ytbeläggningar, Enterokinase
National Category
Medical Biotechnology
Identifiers
URN: urn:nbn:se:kth:diva-257757OAI: oai:DiVA.org:kth-257757DiVA, id: diva2:1348113
Educational program
Master of Science - Medical Biotechnology
Supervisors
Examiners
Available from: 2019-09-16 Created: 2019-09-03 Last updated: 2019-09-16Bibliographically approved

Open Access in DiVA

No full text in DiVA

By organisation
School of Engineering Sciences in Chemistry, Biotechnology and Health (CBH)
Medical Biotechnology

Search outside of DiVA

GoogleGoogle Scholar

urn-nbn

Altmetric score

urn-nbn
Total: 32 hits
CiteExportLink to record
Permanent link

Direct link
Cite
Citation style
  • apa
  • harvard1
  • ieee
  • modern-language-association-8th-edition
  • vancouver
  • Other style
More styles
Language
  • de-DE
  • en-GB
  • en-US
  • fi-FI
  • nn-NO
  • nn-NB
  • sv-SE
  • Other locale
More languages
Output format
  • html
  • text
  • asciidoc
  • rtf