Change search
CiteExportLink to record
Permanent link

Direct link
Cite
Citation style
  • apa
  • ieee
  • modern-language-association-8th-edition
  • vancouver
  • Other style
More styles
Language
  • de-DE
  • en-GB
  • en-US
  • fi-FI
  • nn-NO
  • nn-NB
  • sv-SE
  • Other locale
More languages
Output format
  • html
  • text
  • asciidoc
  • rtf
Expression Levels and Stability of Terpene Cyclase Variants
KTH, School of Engineering Sciences in Chemistry, Biotechnology and Health (CBH).
2019 (English)Independent thesis Basic level (professional degree), 10 credits / 15 HE creditsStudent thesisAlternative title
Uttrycksnivåer och stabilitet hos varianter av terpencyklaser (Swedish)
Abstract [sv]

Terpenes constitute a vast family of organic compounds, which are used for various purposes in the industrial sector. Recently, a study [1] conducted experiments of a reconstructed ancestral spiroviolene synthase (SvS) (modern enzyme from Streptomyces violens) and demonstrated that the ancestral enzymes showed substrate promiscuity towards the compounds geranylgeranyl diphosphate (GGPP), which is the natural substrate and farnesyl diphosphate (FPP). The study also investigated the thermostability of the ancestral enzymes and compared them to the modern enzyme. The study concluded that reconstructed ancestors of spiroviolene synthase possessed higher thermostability and substrate promiscuity (less substrate specificity). [1]

This study aims to investigate the expression levels and stability of terpene cyclase variants. Stability is defined in this study as thermostability. The terpene cyclase variants in this study are derived from SvS-A2, one of the thermostable ancestral enzymes of the previous study.

This study was conducted by laboratory work and included transformation of chemo competent E. coli, protein expression (cell growth, optical density (OD) measurement, protein induction and cell harvest), SDS-PAGE analysis, purification of protein with nickel nitrilotriacetic acid (NiNTA) resin batch mode (manual purification) and ÄKTA, buffer exchange and concentration and nano differential scanning fluorometry (DSF) for the study of thermostability. The set of methods was first applied to SvS-wild type and SvS-A2, which was later applied to variants of A2 such as SvS-AS1, AS3, AS10 and AT2.

The stability of the terpene cyclase variants indicates that SvS-AS10 has a higher thermostability than SvS-AS3. The other terpene cyclase variants were not investigated using nanoDSF.

All the SDS-PAGE expression analyses generally indicate that the protein of interest is in the final stages of the timepoints from induction.

Further research is required to understand the stability of the SvS variants, which can be conducted by the examination of several more variants than this study and measurement of their melting temperatures and their activities.

Abstract [sv]

Terpener utgör en stor familj av organiska föreningar som används för olika ändamål i industrin. Det har tidigare genomförts en studie [1] som utförde experiment på rekonstruerade förfäder av spiroviolene syntas (SvS) (modernt enzym från Streptomyces violens) och demonstrerade att förfäderenzymerna visade substratpromiskuitet mot två föreningar, geranylgeranyl difosfat (GGPP) som är det naturliga substratet och farnesyl difosfat (FPP). Studien undersökte också förfäderenzymernas termostabilitet och jämförde dem med det moderna enzymet. Studien drog slutsatsen att rekonstruerande förfäder till spiroviolene syntas hade högre termostabilitet och substratpromiskuitet (mindre substratspecificitet). [1]

Denna studie har som mål att undersöka uttrycksnivåerna och stabilitet hos varianter av terpencyklaser. Stabilitet definieras i denna studie som termostabilitet. Terpenecyklasvarianterna i denna studie kommer från SvS-A2, en av dem termostabila förfäderenzymerna från den föregående studien.

Denna studie har genomförts genom laborativt arbete och det inkluderade transformation av kemo kompetenta E. coli celler, proteinuttryck (cellväxt, optisk densitet (OD) mätning, proteininduktion och cellskörd), SDS-PAGE analys, proteinrening med nickel nitrilotriättiksyra (NiNTA) genom manuell rening såväl som rening med ÄKTA, buffert utbyte och koncentrering och slutligen nano differential scanning fluorometry (DSF) för att studera termostabilitet. Uppsättningen av metoder tillämpades först med SvS-vildtyps protein och SvS-A2, och senare med varianter av A2 såsom SvS-AS1, AS3, AS10 och AT2.

Stabiliteten hos terpenecyklaservarianterna indikerar att SvS-AS10 har en högre smälttemperatur än SvS-AS3. De andra varianterna undersöktes inte med nanoDSF.

Alla SDS-PAGE proteinuttrycks analyser indikerar generellt sett att stora kvantiteter av protein befinner sig i de sista tidpunkterna från induktionen.

Vidare forskning behövs för att kunna förstå stabiliteten hos SvS varianterna, detta kan genomföras genom undersökning av flera varianter än den här studien samt mätning av deras smälttemperaturer och kinetik.

Place, publisher, year, edition, pages
2019.
Keywords [en]
spiroviolene synthase, thermostability
National Category
Chemical Engineering
Identifiers
URN: urn:nbn:se:kth:diva-266161OAI: oai:DiVA.org:kth-266161DiVA, id: diva2:1382143
Educational program
Bachelor of Science in Engineering - Chemical Engineering
Available from: 2020-01-02 Created: 2020-01-02 Last updated: 2020-01-02Bibliographically approved

Open Access in DiVA

No full text in DiVA

By organisation
School of Engineering Sciences in Chemistry, Biotechnology and Health (CBH)
Chemical Engineering

Search outside of DiVA

GoogleGoogle Scholar

urn-nbn

Altmetric score

urn-nbn
Total: 22 hits
CiteExportLink to record
Permanent link

Direct link
Cite
Citation style
  • apa
  • ieee
  • modern-language-association-8th-edition
  • vancouver
  • Other style
More styles
Language
  • de-DE
  • en-GB
  • en-US
  • fi-FI
  • nn-NO
  • nn-NB
  • sv-SE
  • Other locale
More languages
Output format
  • html
  • text
  • asciidoc
  • rtf