Change search
CiteExportLink to record
Permanent link

Direct link
Cite
Citation style
  • apa
  • ieee
  • modern-language-association-8th-edition
  • vancouver
  • Other style
More styles
Language
  • de-DE
  • en-GB
  • en-US
  • fi-FI
  • nn-NO
  • nn-NB
  • sv-SE
  • Other locale
More languages
Output format
  • html
  • text
  • asciidoc
  • rtf
Production and evaluation ofspider silk protein for sortase Amediatedfunctionalization
KTH, School of Engineering Sciences in Chemistry, Biotechnology and Health (CBH).
2020 (English)Independent thesis Advanced level (degree of Master (Two Years)), 20 credits / 30 HE creditsStudent thesis
Abstract [en]

The recombinant spider silk protein 4RepCT has been functionalized in many ways throughthe years. Sortase A coupling is an important method used when proteins or binders cannot beexpressed as fusion proteins with 4RepCT, because of size, complexity or if the protein is inneed of post-translational modifications. Previous studies have shown that an increasingnumber of glycine residues increase the yield and rate of the enzymatic coupling. The projectaim was to investigate two new silk proteins, 4RepCT-Srt and G5-4RepCT, to be able toevaluate if the sortase A coupling could be improved. The IgG binding domain Z(containingthree N-terminal glycine residues) was coupled both in solution and on coatings of 4RepCTSrt,both on coatings of 4RepCT-Srt and in solution using SDS-PAGE. IgG-fluorophore wasused to be able to detect and get an estimation of coupled product (4RepCT-Z), and SDSPAGEwas used to estimate the amount and rate of product formation, which was comparedto the wild type silk, G-4RepCT. The G5-4RepCT had to be re-cloned, due to difficulties inexpression and purification of the previous construct. The results show that three or moreglycines improve the rate of coupling, and 4RepCT-Srt works at least as efficient as the4RepCT. Improved sortase coupling could be beneficial for future cancer immunotherapyusing 4RepCT silk, where sortase can be used to covalently attach antibody fragments to thesilk.

Abstract [sv]

Det rekombinanta spindelsilket 4RepCT har genom åren funktionaliserats på många sätt.Sortase A-koppling är en viktig metod som används när proteiner eller bindaren inte kanuttryckas som ett fusionsprotein med 4RepCT, p.g.a. storlek, komplexitet eller om proteinetbehöver post-translationella modifikationer. Tidigare studier har visat att ett ökat antal avaminosyran glycin ökar utbytet och hastigheten för den enzymatiska kopplingen. Projektetsmål var att utvärdera två nya silkeproteiner, 4RepCT-Srt och G5-4RepCT, för att kunnautvärdera om sortas A kopplingen var möjlig att förbättras. 4RepCT-Srt kopplades till IgGbindningsdomänenZ (innehållande tre N-terminala glyciner), både vid coating av 4RepCTSrtoch i lösning med användning av SDS-PAGE. IgG-fluorofor användes för att kunnadetektera och få en uppskattning av mängden koppling mellan silket och Z (4RepCT-Z), SDSPAGEutfördes för att kunna uppskatta hastigheten för produktbildning och mängd, detta4genom att jämföra med viltyp-silket, GP- 4RepCT. G5-4RepCT behövde klonas om på grundav tidigare uttrycks- och reningssvårigheter. Resultaten av sortas A-koppling i lösningar ochpå coating av silket bekräftade att tre eller mer glyciner ökar hastigheten av kopplingen, ochatt 4RepCT-Srt fungerar minst lika effektivt som 4RepCT. En mer effektiv sortas A-kopplingtill är önskvärd för framtida cancerimmunoterapi, där sortas kan användas för att bindaantikroppsfragment kovalent till silket, 4RepCT.

Place, publisher, year, edition, pages
2020.
Series
TRITA-CBH-GRU ; 2020:032
Keywords [en]
Spider silk, 4RepCT, functionalization, Z domain, sortase A coupling, silk coatings.
Keywords [sv]
Spindelsilke, 4RepCT, funktionalisering, Z-domän, sortas A-koppling, coating
National Category
Medical Biotechnology
Identifiers
URN: urn:nbn:se:kth:diva-271660OAI: oai:DiVA.org:kth-271660DiVA, id: diva2:1421364
Educational program
Master of Science in Engineering - Biotechnology
Supervisors
Examiners
Available from: 2020-04-02 Created: 2020-04-02 Last updated: 2020-04-02Bibliographically approved

Open Access in DiVA

No full text in DiVA

By organisation
School of Engineering Sciences in Chemistry, Biotechnology and Health (CBH)
Medical Biotechnology

Search outside of DiVA

GoogleGoogle Scholar

urn-nbn

Altmetric score

urn-nbn
Total: 44 hits
CiteExportLink to record
Permanent link

Direct link
Cite
Citation style
  • apa
  • ieee
  • modern-language-association-8th-edition
  • vancouver
  • Other style
More styles
Language
  • de-DE
  • en-GB
  • en-US
  • fi-FI
  • nn-NO
  • nn-NB
  • sv-SE
  • Other locale
More languages
Output format
  • html
  • text
  • asciidoc
  • rtf