The brain is protected by biological barriers, including the blood–brain barrier (BBB), which is crucial for brain homeostasis. However, the barriers compose a potential obstacle for brain drug delivery as intravenously administered drugs are not able to sufficiently reach the brain parenchyma. Approaches to enable BBB crossing include targeting native receptors to deliver drugs via receptor-mediated transcytosis. Two affibodies have been developed at KTH for such purposes. This master’s thesis project contributed to the affinity maturation process of the two affibodies. For each variant, two libraries were generated: one error-prone PCR library, and one rational designed library. Prior to the library creations, mutants of the affibodies were analysed and the residue-specific amino acid contributions were considered in the library creation process. Rational designed libraries were designed and ordered as oligonucleotides. Error-prone PCR libraries were created as E. coli cell libraries, with estimated library sizes of 50 million variants. Selections of the error-prone PCR libraries were conducted through E. coli display, where characteristics of affinity, thermostability, pH-dependency and on-rate were included in the selection strategy. Four consecutive selections, divided into two parallel tracks, were performed. Flow cytometry analysis confirmed the presence of binders within the libraries.

Hjärnan skyddas av biologiska barriärer, så som blod–hjärnbarriären, vilket är avgörande för att upprätthålla hjärnhomeostas. Samtidigt utgör dessa barriärer ett potentiellt hinder för behandling av hjärnsjukdomar, då läkemedel som ges intravenöst inte lyckas ta sig över barriärerna för att verka i hjärnparenkymet. En strategi för att leverera läkemedel till hjärnan är att utnyttja nativa receptorer som möjliggör receptormedierad transcytos. Två receptor- bindande affibodymolekyler har utvecklats på KTH. Detta projekt bidrog till affinitetsmaturering av de två affibodymolekylerna. För varje variant skapades två bibliotek: ett error-prone PCR bibliotek, och ett rationellt designat bibliotek. Innan biblioteken skapades analyserades enskilda mutanter, och bidragen av enskilda mutationer för affiniteten togs i beaktning under biblioteksskapandet. De rationellt designade biblioteken utformades och beställdes som oligonukleotider. Error-prone PCR biblioteken gjordes till E. coli cell bibliotek med uppskattningsvis 50 miljoner varianter. Selektioner av error-prone PCR biblioteken utfördes genom E. coli display, där affinitet, termostabilitet, pH-beroende och associationsfart selekterades för. Tre sekventiella selektioner, i två parallella spår, utfördes. Flödescytometrisk analys visade att bindande varianter fanns i biblioteken.