Mucus covers the epithelium surfaces playing a key role in the barrier, hydration, lubrication and bioactivity functions for the human body, and mucins are the fundamental components of mucus which provide such functions. However, many details in how these functions are related to the many structural features of mucins are still unknown. In this thesis, strategies were developed to modify mucin structures in defined ways to gain insights and controls over several key functions of this molecule. We altered functional motifs on the mucin molecules, and changed the conformation of mucin networks to modulate the accessibility of such functional motifs. Then functional outcomes, including macrophage responses, diffusion of molecules through mucin networks, and mucin lubricity were studied. This thesis is organized into three parts according to the three functions. 

We found that the responses of macrophage to mucins were modulated by changing the location of crosslinks between mucins and by the immobilization of mucins onto surfaces. Mucins’ bottle-brush structure allowed their crosslinking either via the protein backbone or via the glycan side chains with similar crosslinking density. With the same crosslinking structure, the placement of mucin thin film on hard substrate and soft substrate led to different macrophage responses, and only mucin coating on soft gel induced similar immune responses as that of mucin gels. A better understanding of how mucin bioactivity, and specifically immune-modulating properties, can be modulated, provide new strategies to develop biomaterials with defined bioactivities. This work could also inspire innovative treatments to modulate mucin bioactivities in vivo to treat mucin-related diseases such as for mucinous cancers.  

The diffusion of molecules through mucin gels was modulated by changing the gel network and their affinity filtration capacity. By locating the crosslinking sites on the protein backbone or the glycan chains, the gel network remained the same with similar diffusion profiles of dextrans. However, with simple change of mucin concentration, molecules of different size diffused faster in gels with lower mucin concentration. The affinity filtration of mucin gel was modulated by removing sialic acids, which acts as binding sites for molecules or cells via electrostatic interactions or specific binding, and the binding can slow down diffusion of cells or molecules. By altering sialic acid contents, the diffusion of charged dextran was modulated and the penetration of sperms was increased. With the understanding, mucin gels with controlled permeability can be designed for loading drugs or encapsulating tissue. And strategies can be developed in the future for treating mucus barrier related disease in vivo, such as inflammatory bowel disease.

The hydration & lubrication of mucin coating was modulated with changed mucin structure and removal of associated impurities. The hydration of mucin coatings remained the same, but their lubricity was lost by removing negatively charged sugars. However, the components associated with mucin, such as DNA, compensated for the missing of negative sugars. Commercial PGM was found with damaged glycosylation and missing peptide domains, and its lubricity was lost completely compared to lab-purified mucins. With this knowledge, mucin structure can be modulated for desired hydration and lubrication performance, and this can inspire to develop strategies for restoring their hydration and lubricity in vivo during diseases, such as dry eye.

Slem täcker epitelytorna som spelar en nyckelroll i barriär-, hydrerings-, smörjnings- och bioaktivitetsfunktionerna för människokroppen, och muciner är de grundläggande komponenterna i slem som tillhandahåller sådana funktioner. Men många detaljer i hur dessa funktioner är relaterade till mucinernas många strukturella egenskaper är fortfarande okända. I denna avhandling utvecklades strategier för att modifiera mucinstrukturer på definierade sätt för att få insikt och kontroll över flera nyckelfunktioner hos dessa molekyler. Vi ändrade funktionella motiv på mucinmolekylerna och ändrade konformationen av mucinnätverk för att modulera tillgängligheten för sådana funktionella motiv. Sedan studerades funktionella resultat, inklusive makrofagsvar, diffusion av molekyler genom mucinnätverk och mucinsmörjbarhet. Denna avhandling är organiserad i tre delar enligt de tre funktionerna.

Vi fann att svaren från makrofager på muciner modulerades genom att ändra platsen för tvärbindningar mellan muciner och genom immobilisering av muciner på ytor. Mucins flaskborstestruktur tillät tvärbindningar antingen via proteinryggraden eller via glykansidokedjorna med liknande tvärbindningstäthet. Med samma tvärbindande struktur ledde placeringen av tunna filmer av mucin på hårda substrat och mjuka substrat till olika makrofagsvar, och endast mucinbeläggning på mjuka geler inducerade liknande immunsvar som mucingeler. En bättre förståelse för hur mucinbioaktivitet, och specifikt hur immunmodulerande egenskaper kan moduleras, ger nya strategier för att utveckla nya biomaterial med definierade bioaktiviteter. Detta arbete kan också inspirera till nya strategier för att modulera mucinbioaktiviteten in vivo för att behandla mucinrelaterade sjukdomar såsom mucinös cancer.

Diffusionen av molekyler genom mucingeler modulerades genom att ändra gelnätverket och deras affinitetsfiltreringskapacitet. Genom att lokalisera tvärbindningsställena på proteinryggraden eller glykankedjorna förblev gelnätverket detsamma med liknande diffusionsprofiler för dextraner. Men med enkel förändring av mucinkoncentration diffunderade molekyler av olika storlek snabbare i geler med lägre mucinkoncentration. Affinitetsfiltreringen av mucingeler modulerades genom att ta bort sialinsyra, som fungerar som ett bindningsställe för molekyler eller celler via elektrostatiska interaktioner eller specifik bindning, och bindningen kan bromsa diffusion av celler eller molekyler. Genom att ändra sialinsyrainnehållet modulerades diffusionen av laddat dextran och penetrationen av spermier ökades. Med denna förståelse så kan mucingeler med kontrollerad permeabilitet utformas för att införa läkemedel eller inkapsla vävnad. Och strategier kan utvecklas i framtiden för att behandla slembarriärrelaterad sjukdom in vivo, såsom inflammatorisk tarmsjukdom.

Hydratiseringen och smörjningen av mucinbeläggningen modulerades med förändrad mucinstruktur och avlägsnande av tillhörande föroreningar. Hydratiseringen av mucinbeläggningen förblev densamma, men dess smörjförmåga förlorades genom att negativt laddade sockerarter avlägsnades. Komponenterna associerade med mucin, såsom DNA, kompenserade dock för saknaden av negativa sockerarter. Kommersiell PGM hittades med skadad glykosylering och saknade peptiddomäner, och dess smörjförmåga förlorades helt jämfört med labbrenade muciner. Med denna kunskap kan mucinstrukturen moduleras för önskad hydrering och smörjprestanda, och detta kan inspirera till att utveckla nya strategier för att återställa deras hydrering och smörjighet in vivo under sjukdomar, såsom torra ögon.

上皮细胞表面覆盖的黏液在人体的防御、保湿作用、润滑和生物活性等功能中起关键作用，而黏液中提供这些功能的根本成分是黏蛋白。然而，关于这些功能如何与黏蛋白的多种结构特征相互作用的很多细节仍然是未知的。在本论文中，我们研究出针对黏蛋白结构的可控调节策略，并对它的几个关键功能进行深入的探究和调控。我们改变了黏蛋白分子上的功能基元数量，以及黏蛋白网络的构象从而调节这些功能基元的可及性。我们然后研究了相应的功能变化，包括巨噬细胞响应、分子在黏蛋白网络中的扩散和黏蛋白的润滑性能。本论文根据这三个功能分为三个部分。

我们通过改变黏蛋白之间的交联位置和将黏蛋白固定在材料表面，调节了巨噬细胞对黏蛋白的免疫响应。黏蛋白的瓶刷状分子结构允许它们通过蛋白质骨架或聚糖侧链进行交联，而且它们的交联密度可以控制一致。在交联方式相同的情况下，接枝在高强度材料和低强度材料上的黏蛋白薄膜会引起不同的巨噬细胞响应，只有覆盖黏蛋白涂层的柔软凝胶诱导的免疫响应与黏蛋白凝胶相似。这些结果让我们更好地了解如何调节黏蛋白的生物活性，特别是对免疫响应的调节特性，为开发具有特定生物活性的生物材料提供了新的思路。这项工作还可以启发我们开发出新的方法来调节人体内黏蛋白的生物活性，用于治疗涉及黏蛋白的疾病，例如黏液癌。

我们通过调节凝胶网络结构及其亲和过滤能力，来调节分子在黏蛋白凝胶中的扩散。通过改变黏蛋白之间的交联位点在蛋白质骨架或聚糖链上，相应的凝胶网络结构保持相同，葡聚糖在这些凝胶中的扩散曲线基本相同。然而，通过简单地改变黏蛋白浓度，不同大小的分子在黏蛋白浓度较低的凝胶中扩散得更快。我们通过移除黏蛋白中的唾液酸含量调节了黏蛋白凝胶的亲和过滤性能，唾液酸通过静电相互作用或特异性结合作用成为分子或细胞的结合位点，这种结合作用可以减缓细胞或分子的扩散。通过改变唾液酸含量，我们调节了带电葡聚糖在凝胶中的扩散并使更多精子细胞穿透子宫黏液。通过这些结果，我们可以设计具有可控渗透性的黏蛋白凝胶，用于装载药物或包埋细胞组织。未来，我们也可以以此开发方案用于治疗涉及体内黏液防御能力相关的疾病，例如炎症性肠病。

我们通过改变黏蛋白分子结构和移除相关杂质成分来调节黏蛋白涂层的保湿和润滑性能。移除带负电荷的糖之后，黏蛋白涂层的保湿性能保持不变，但它们的润滑性能因此丢失了。然而，与黏蛋白关联的成分，如DNA，可以补偿丢失负电糖对润滑性能的影响。与实验室纯化的黏蛋白相比，我们发现商品化的猪胃黏蛋白具有受损的糖基化和缺失的肽结构片段，其润滑性能因此完全丧失。通过对这些方面的理解，我们可以通过调节黏蛋白分子结构以获得所需的保湿和润滑性能，这可以启发研究者开发新的策略用来恢复体内黏蛋白在疾病期间的保湿作用和润滑性能，例如干眼症。

The work presented in this doctoral thesis explores multicellular, biological, and biotechnological applications for microfluidic droplets, making use of a number of unique features of these miniaturized, highly scalable reaction vessels.

Droplet microfluidics specializes in pico- to nanoliter sized aqueous droplets in an immiscible oil phase, borrowing techniques from the field of microfluidics, namely fluid actuation, detection systems and electronic peripherals. A lot of these techniques have been made possible by discoveries and inventions originally developed for microelectronics and relate to the fabrication of micrometer scale features. Channels with a width and depth of fractions of a millimeter allow for the reliable and precise manipulation of fluids necessary to achieve high throughput while maintaining accuracy.

Many subdisciplines of biological research rely on scale, on strength in numbers, in a sense that only a sufficient number of samples enables insights into the genome, transcriptome, or proteome of an organism, into the heterogeneity of populations, into the efficacy of a prospective drug. Just like some other single-cell analysis techniques, such as flow cytometry, droplet microfluidics facilitates that scale of analysis. However, in addition to this, droplet microfluidics as a technology platform is capable of processing and analyzing multicellular ensembles, or interrogating extracellular traits. This is especially beneficial for biotechnological or pharmaceutical research applications.

In Paper I, we investigated the encapsulation of insulin secreting cells in mucin gel beads. The gel protects the cells against a host’s immune system response while allowing for nutrient and gas passage as well as diffusion of the secreted insulin.

In Paper II, we present a high-throughput production and analysis workflow for droplet-assisted spheroid formation. We use deep learning to train a model to support the optimization of droplet incubation conditions. The resulting minispheroids enable large-scale 3D cell culture model screening.

In Paper III, we developed and characterized a portable, compact droplet generation setup, using exclusively commercially available parts and demonstrated its versatility by dynamically tuning droplet size and composition. Finally, we demonstrated its use for the encapsulation of human primary cells to form spheroids in the sterile environment of a biosafety cabinet.

For Paper IV, we developed an integrated fluorescence area sorting approach to sort cell colonies in microfluidic droplets. After validating the sorter, we screened yeast microcolonies in droplets and used averaging over the entire droplet width to ameliorate the impact of cell heterogeneity within isoclonal populations.

Det arbete som presenteras i den här doktorsavhandlingen utforskar multicellulära, biologiska och biotekniska tillämpningar för mikrofluidiska droppar och utnyttjar ett antal unika egenskaper hos dessa miniatyriserade reaktionskärl.

Droppmikrofluidik använder pico- till nanoliterstora vattendroppar i en oljefas som inte löser vatten, och lånar tekniker från området mikrofluidik, nämligen vätskestyrning, detektionssystem och elektronisk kringutrustning. Många av dessa tekniker har möjliggjorts genom upptäckter och uppfinningar som ursprungligen utvecklades för mikroelektronikproduktion och omfattar tillverkning av strukturer i mikrometerskala. Kanaler med bredd och djup i storleksordningen bråkdelsmillimeter möjliggör den tillförlitliga och exakta hantering av vätskor som krävs för att uppnå hög genomströmning med bibehållen noggrannhet.Många underdiscipliner inom biologisk forskning är beroende av storskaliga analyser, som ger strength in numbers, i den meningen att endast ett tillräckligt stort antal prover ger insikt i en organisms genom, transkriptom eller proteom, i populationers heterogenitet eller i ett framtida läkemedels effektivitet. Precis som vissa andra tekniker för analys av enstaka celler, t.ex. flödescytometri, så möjliggör droppmikrofluidik stora antal analyser. Dessutom kan droppmikrofluidik som teknisk plattform bearbeta och analysera flercelliga ensembler eller undersöka extracellulära egenskaper. Detta är särskilt fördelaktigt för biotekniska eller farmaceutiska forskningstillämpningar.

I artikel 1 undersöker vi hur insulinproducerande celler kan kapslas in i mucingel-droppar. Den gel som används kan skydda cellerna, till exempel efter en transplantation, från ett kraftigt immunsvar, samtidigt som den tillåter passage av näringsämnen och gaser samt spridning av utsöndrat insulinet.

I artikel II presenterar vi ett arbetsflöde för droppassisterad sfäroidbildning för produktion och analys med hög genomströmning. Vi använder deep learning för att träna en modell som stöd för optimering av inkubationsförhållanden i dropparna. De resulterande minisfäroiderna möjliggör storskalig screening med 3D-cellkulturmodeller.

Artikel 3 handlar om utveckling och utvärdering av ett litet och bärbart lågkostnads-instrument med enbart kommersiellt tillgängliga komponenter och visar dess mångsidighet genom att dynamiskt anpassa dropparnas storlek och sammansättning. Slutligen visade vi att instrumentet kan användas för inkapsling av primära mänskliga celler för att bilda sfäroider i ett biosäkerhetsskåp.

I artikel 4 använder vi mikrofluidiska droppar för att förbättra biotekniska screening-kampanjer. Vi undersöker mikrokolonier av jäst i stället för enskilda celler i droppar för att mäta ett genomsnittligt värde för flera celler med samma arvsmassa. Detta medelvärde är mer informativt än en mätning av enskilda celler, eftersom det minskar mätvariationen på grund av minimala variationer celler emellan som annars skulle förhindra utsortering av de bästa cellvarianterna.