The societal goal of reaching net-zero CO₂ emissions requires development of integrated biorefineries to produce biomass-derived fuels and chemicals. For sustainable second-generation bioethanol production, consolidated bioprocessing with the thermophile Clostridium thermocellum is regarded as a promising concept in view of the microorganism’s native ability to efficiently degrade plant cell wall material. However, for industrial implementation, improvements in ethanol titer and yield are needed. The aim of this thesis was to increase knowledge on the metabolism of C. thermocellum and thereby guide future metabolic engineering strategies to maximize the ethanol yield and titer.

Yield improvements and fundamental studies into the metabolism of C. thermocellum would benefit from higher utilization of hexose monomers as well as minimized byproduct formation. To investigate underlying mechanisms for growth on glucose and fructose, laboratory evolution in chemostats together with genome sequence-based reverse engineering was applied. This successfully revealed two underlying mutations with (regulatory) roles in metabolism or transport of the monosaccharides. Together, these mutations enable reproducible and constitutive growth and are relevant for follow-up studies into transport and upper glycolysis. Separately, the mechanism behind the surprising byproduct formation of secreted amino acids was investigated by knock-out studies in NADPH-supplying and -consuming pathways. Physiological characterization in cellobiose- or ammonium-limited chemostats of mutant strains, with deletions in the NADPH-forming malate shunt or in the putatively ferredoxin-dependent ammonium assimilation, demonstrated a central role of NADPH in driving amino acid secretion. The findings indicated that electron availability will be crucial for further yield improvements in the NADH-dependent ethanol pathway.

Fundamental mechanisms that might contribute to improved ethanol titer were addressed by studying thermodynamic and biophysical limitations. The pyrophosphate (PP_i)-dependent glycolysis of C. thermocellum has been hypothesized to increase the overall ATP yield at the expense of the overall driving force. Knock-out studies combined with functional annotation of potential PP_i-sources questioned this trade-off and increased knowledge of the PP_i metabolism. The chaotropic effect (biophysical toxicity) of ethanol is commonly counteracted by lowering the cultivation temperature. Here, physiological characterization at varying ethanol titers demonstrated improved growth and fermentation at lower temperature. Comparisons to a non-ethanol producing mutant indicated both thermodynamic and biophysical limitations specifically in the ethanol pathway.

Overall, these findings suggest that improvements in ethanol yield and titer would benefit from a simplified glycolysis that is engineered for a high driving force. While this work is beneficial for second-generation ethanol production, these findings can also be broadly applicable in the research and development of C. thermocellum as a cell factory for sustainable production of other fuels and chemicals. 

Samhällsmålet att nå nettonoll CO₂ utsläpp kräver att integrerade bioraffinaderier utvecklas för att producera bränslen och kemikalier baserade på biomassa. För hållbar andra-generationens bioetanol-produktion betraktas konsoliderad bioprocessering med termofilen Clostridium thermocellum som ett lovande koncept, utifrån dess naturliga förmåga att effektivt bryta ner växtcellväggar. Emellertid krävs ökad titer och utbyte av etanol för att nå industriell implementering. Målet med denna avhandling var att öka kunskapen om C. thermocellums metabolism och därmed vägleda framtida strategier för att maximera utbytet och titern av etanol genom metabolic engineering.

Förbättringar i utbytet samt fundamentala studier på metabolism hos C. thermocellum skulle gynnas av ett större utnyttjande av C₆-mono-sackarider samt minskad produktion av biprodukter. Underliggande mekanismer för tillväxt på glukos och fruktos undersöktes med laboratory evolution i kemostater samt genomsekvensbaserad reverse engineering. I denna studie avslöjades två underliggande mutationer med (regulatoriska) roller i metabolismen eller transporten av dessa monosackarider. Tillsammans möjliggjorde dessa mutationer reproducerbar och konstitutiv tillväxt. Mutationerna är även relevanta för uppföljningsstudier av sockertransport och den övre glykolysen. Därutöver studerades den oväntade biproduktgruppen, aminosyror, genom knockoutstudier på NADPH-producerande och -konsumerande reaktionsvägar. Stammar med knockouts i den NADPH-producerande malatshunten eller i den potentiellt ferredoxin-kopplade ammoniumassimileringen karaktäriserades fysio-logiskt i cellobios- och ammoniumbegränsande kemostater. Detta visade att NADPH har en central roll i att driva aminosyrautsöndring. Dessa upptäckter indikerade att elektrontillgänglighet är kritiskt för att öka utbytet i den NADH-beroende etanolproduktionen. 

Fundamentala mekanismer som skulle kunna bidra till förbättrad titer av etanol studerades från termodynamiska och biofysiska perspektiv. En rådande hypotes har varit att den pyrofosfat (PP_i)-beroende glykolysen hos C. thermocellum ökar ATP-utbytet på bekostnad av den totala termodynamiska drivkraften. Knockoutstudier kombinerat med funktionell annotering av potentiella PP_i-källor ifrågasatte denna hypotes och ökade förståelsen av PP_i metabolismen. Den kaotropiska effekten (biofysisk toxicitet) av etanol dämpas ofta i industriella processer genom att sänka odlingstemperaturen. Här demonstrerade fysiologisk karaktärisering vid olika etanoltiter att tillväxt och fermentering förbättras vid lägre temp-eraturer. En jämförelse mellan en modifierad icke-etanolproducerande stam och vildtypen indikerade att etanolproduktionen är begränsad av både termodynamiska och biofysiska faktorer. 

I helhet antyder dessa forskningsresultat att förbättringar i utbytet och titern av etanol skulle gynnas av en förenklad glykolys, konstruerad för att ge en hög termodynamisk drivkraft. Fastän denna avhandling fokuserar på andra-generationens etanolproduktion, kan dessa forskningsrön även appliceras mer brett i forskning och utveckling av C. thermocellum som en cellfabrik för hållbar produktion av andra bränslen och kemikalier.