I denna avhandling undersöks en modifiering av Calvin-cykeln, den primära metaboliska vägen för CO2-fixering, i syfte att förbättra dess energieffektivitet. Den föreslagna modifieringen ersätter fosforibulokinas (PRK), ett nyckelenzym som fosforylerar 5-kolssockret ribulos-5-fosfat med ATP. Det ersättande enzymet är ett PPi-beroende fosfofruktokinas (PPi-PFK), som potentiellt skulle kunna utföra fosforyleringen med pyrofosfat istället för ATP. Eftersom PPi-PFK normalt är specifika för sockerarter med 6 kolatomer renades och testades in vitro aktiviteten hos fem PPi-PFK kandidater för fosforylering av ribulos-5-fosfat. Experimenten visade att ingen av PPi-PFK kandidaterna kunde underlätta fosforyleringen av ribulos-5-fosfat till ribulos-1,5-bisfosfat in vitro. I en annan del av avhandlingen försökte jag skapa en genetisk knockout av den ursprungliga PRK-genen i Cupriavidus necator, en bakterie som använder Calvin-cykeln. Denna knockout-stam skulle användas för in vivo-testning av PPi-PFK. Ingen av PPi-PFK-kandidaterna kunde funktionellt ersätta PRK in vivo.  Därför kommer skapandet av ett PPi-PFK-enzym som är aktivt på ribulos-5-fosfat sannolikt att kräva att proteins substratspecificitet designas om.

This thesis explores a modification of the Calvin-Benson-Bassham cycle, the primary metabolic pathway for CO2 fixation, with the aim to improve its energetic efficiency. The proposed modification replaces phosphoribulokinase (PRK), a key enzyme that phosphorylates the 5-carbon sugar ribulose-5-phosphate with ATP. The replacement enzyme  is a PPi-dependent phosphofructokinase (PPi-PFK), which could potentially perform the phosphorylation using pyrophosphate instead of ATP. Since PPi-PFKs are typically specific for 6-carbon sugars, I purified and tested in vitro the activity of five candidate PPi-PFKs for phosphorylation of ribulose-5-phosphate. The experiments showed that none of the candidate PPi-PFKs were able to facilitate the phosphorylation of ribulose-5-phosphate to ribulose-1,5-bisphosphate in vitro. In another part of the thesis, I attempted to create a genetic knockout of the native PRK gene in Cupriavidus necator, a bacterium that uses the Calvin-Benson-Bassham cycle. This knockout strain was to be used for in vivo testing of PPi-PFKs. None of the candidate PPi-PFKs could functionally replace the PRK in vivo. Therefore, creation of a PPi-PFK enzyme that is active on the ribulose-5-phosphate will likely require protein engineering of substrate specificity.