Cancer is a major public health challenge and the second leading cause of death in the world, with millions of new cases being diagnosed each year. Traditional cancer treatments such as surgery, radiation therapy, and chemotherapy are many times effective, but may also cause damage to healthy cells, leading to side effects. Targeted therapy is a more precise and focused approach to cancer treatment, where the aim is to target the cancer cells while leaving the normal cells unaffected. It is particularly effective in cancers where specific molecular targets are known, such as the subset of breast cancer patients with HER2 over-expression or in the subset of patients with pancreatic cancer with HER3 over-expression. 

Antibody-drug conjugates (ADCs) are an important addition to tumor-targeted therapy, with twelve drugs approved for clinical use by the FDA. They utilize the high specificity of monoclonal antibodies conjugated with highly cytotoxic small molecules to enhance the accumulation of the drugs in the tumor, for highly specific and efficient killing. However, traditional ADCs may not be the optimal delivery format for the directed delivery of cytotoxic drugs. They are limited by their relatively large molecular weights, resulting in relatively low penetration of solid tumors. 

Recently, a novel type of drug conjugates, affibody-drug conjugates, has been described. These combined an engineered scaffold affinity protein, an affibody molecule, with an albumin binding domain (ABD) for half-life extension, to which a cytotoxic payload has been conjugated. Previous studies show that these novel drug conjugates have a potent and tumor-cell-specific cytotoxic effect. In the future, they may therefore become complementary or alternatives to current targeted cancer therapies. 

This thesis focuses on the optimization of affibody-drug conjugates targeting HER2 and HER3, members of the human epidermal growth factor receptor family. The thesis presents in vitro and in vivo preclinical data, showing the potential for further clinical development. In paper I, we investigated the influence of the drug-to-affibody ratio (DAR) on the pharmacokinetic profile of affibody-drug conjugates targeting HER2. Increasing the drug load resulted in an elevated delivery of the DM1 drug to the tumors; however, it also led to increased uptake by the liver. Further optimization of the molecular design is necessary to enable highly efficient delivery to tumors while minimizing the uptake in normal organs and tissues. In paper II, the effect of the length and composition of the linker between the HER2 targeting affibody molecule and the ABD was investigated. The use of a 12 amino acids linker reduced hepatic uptake compared with the use of a 5 amino acids linker. This finding offers an important insight into the influence of the linker on the properties of the affibody drug conjugates. In paper III, we investigated the influence of different cytotoxic payloads, as part of an affibody-drug conjugate targeting HER2, on binding properties, cytotoxicity, biodistribution, and anti-tumor effect. The combination of a potent cytotoxic effect in vitro, and a high tumor uptake in vivo, resulted in a superior anti-tumor effect for ZHER2- ABD-mcMMAF at lower doses compared to the previously investigated ZHER2-ABD- mcDM1. Importantly, it maintained a favorable toxicity profile with lower liver uptake compared to ZHER2-ABD-mcDM1. The affibody-drug conjugate ZHER2-ABD- mcMMAF holds great promise as a valuable agent for HER2-targeted cancer therapy. In paper IV, we generated a series of HER2-targeted affibody-drug conjugates fused with different PAS or XTEN polypeptides. We evaluated the ability of the XTEN and PAS polypeptides to extend the plasma half-life, and their influence on tumor uptake, and tissue biodistribution. We compared our new constructs with the previously developed construct, ZHER2-ABD-mcDM1, where an albumin binding domain was used for half-life extension. It was found that the ABD-fused affibody-drug conjugate demonstrated superior tumor uptake and tumor-to-normal-organ ratios compared to the PASylated and XTENylated affibody-drug conjugates. It is possible that ABD is better also for other cancer-targeting strategies where a high tumor uptake while maintaining comparable accumulation in normal tissues is desired. In paper V, we compared the binding properties and cytotoxic potential of a monovalent and a bivalent HER3-targeting affibody-drug conjugate. The biodistribution and therapeutic potential of the bivalent drug construct were evaluated. We found that the bivalent ZHER3-ABD-ZHER3- mcDM1 is a highly potent drug conjugate with favorable biodistribution and anti-tumor efficacy. These results suggest that ZHER3-ABD-ZHER3-mcDM1 holds promise for future clinical development as a potential therapeutic option for patients with HER3 over-expressing cancer. 

In summary, the potential for modification and optimization through the design of diverse components within HER2 and HER3-targeting affibody-drug conjugates significantly enhances therapeutic effectiveness, thereby encouraging prospective advancements in the development of targeted drug conjugates. 

Cancer är en stor folkhälsoutmaning och den näst vanligaste dödsorsaken i världen, med miljontals nya fall som diagnostiseras varje år. Traditionella cancerbehandlingar som kirurgi, strålbehandling och kemoterapi är många gånger effektiva, men kan också orsaka skador på friska celler, vilket leder till biverkningar. Riktad terapi är ett mer exakt och fokuserat tillvägagångssätt för cancerbehandling, där syftet är att rikta in sig på cancercellerna samtidigt som de normala cellerna lämnas opåverkade. Det är särskilt effektivt vid cancer där specifika molekylära mål är kända, såsom undergruppen av bröstcancerpatienter med HER2-överuttryck eller i undergruppen patienter med pankreascancer med HER3-överuttryck. 

Antikroppsläkemedelskonjugat (ADC) är en viktig typ av tumörriktad terapi, med tolv läkemedel godkända för klinisk användning av FDA. De utnyttjar den höga specificiteten hos monoklonala antikroppar och är konjugerade med mycket cytotoxiska läkemedel för att öka ackumuleringen av läkemedlen i tumören, för mycket specifikt och effektivt dödande. Traditionella ADC:er är dock kanske inte det optimala formatet för riktad leverans av cellgifter. De begränsas av sina relativt höga molekylvikter, vilket resulterar i relativt låg penetration av solida tumörer. 

Nyligen har en ny typ av läkemedelskonjugat, affibody-läkemedelskonjugat, beskrivits. Dessa kombinerade ett designat bindarprotein, en affibodymolekyl, med en albuminbindande domän (ABD) för förlängning av halveringstiden, till vilken ett cytotoxiskt läkemedel har konjugerats. Tidigare studier visar att dessa nya läkemedelskonjugat har en potent och tumörcellspecifik cytotoxisk effekt. I framtiden kan de därför bli komplementära eller alternativ till nuvarande riktade cancerterapier. 

Denna avhandling fokuserar på optimering av affibody-läkemedelskonjugat riktade mot HER2 och HER3, medlemmar av ”human epidermal growth factor receptor” familjen”. Avhandlingen presenterar in vitro och in vivo prekliniska data, som visar potentialen för ytterligare klinisk utveckling. I artikel I undersökte vi påverkan av läkemedel-till-affibody-förhållandet (DAR) på den farmakokinetiska profilen för affibody-läkemedelskonjugat som riktar sig mot HER2. Ökning av läkemedelsantalet resulterade i en förhöjd ackumulering av DM1-läkemedlet i tumörerna; men det ledde också till ökat upptag i levern. Ytterligare optimering av den molekylära designen är nödvändig för att möjliggöra högeffektiv leverans till tumörer samtidigt som upptaget i normala organ och vävnader minimeras. I artikel II undersöktes effekten av längden och sammansättningen av länken mellan den HER2-målsökande affibodymolekylen och ABD. Användningen av en länk med 12 aminosyror minskade leverupptaget jämfört med användningen av en länk med 5 aminosyror. Detta fynd ger en viktig insikt i länkens inverkan på egenskaperna hos affibody-läkemedelskonjugaten. I artikel III undersökte vi påverkan av olika cytotoxiska läkemedel, som en del av ett affibody- läkemedelskonjugat riktat mot HER2, på bindningsegenskaper, cytotoxicitet, biodistribution och antitumöreffekt. Kombinationen av en potent cytotoxisk effekt in vitro, och ett högt tumörupptag in vivo, resulterade i en överlägsen antitumöreffekt för ZHER2-ABD-mcMMAF vid lägre doser jämfört med den tidigare undersökta ZHER2- ABD-mcDM1. En viktig observation var att den bibehöll en gynnsam toxicitetsprofil med lägre leverupptag jämfört med ZHER2-ABD-mcDM1. Affibody- läkemedelskonjugatet ZHER2-ABD-mcMMAF är lovande som ett framtida läkemedel för HER2-riktad cancerterapi. I papper IV genererade vi en serie HER2-riktade affibody-läkemedelskonjugat fusionerade med olika PAS- eller XTEN-polypeptider. Vi utvärderade förmågan hos XTEN- och PAS-polypeptiderna att förlänga halveringstiden i blodet och deras inverkan på tumörupptag och vävnadsbiodistribution. Vi jämförde våra nya konstruktioner med den tidigare utvecklade konstruktionen, ZHER2-ABD-mcDM1, där en albuminbindande domän användes för förlängning av halveringstiden. Det visade sig att det ABD-fusionerade affibody- läkemedelskonjugatet visade överlägset tumörupptag och tumör-till-normalt-organ- förhållanden jämfört med de PASylerade och XTENylerade affibody- läkemedelskonjugaten. Det är möjligt att ABD är bättre även för andra cancerinriktade strategier där ett högt tumörupptag med bibehållen jämförbar ackumulering i normala vävnader önskas. I artikel V jämförde vi bindningsegenskaperna och den cytotoxiska potentialen för ett monovalent och ett bivalent HER3-riktat affibody- läkemedelskonjugat. Biodistributionen och den terapeutiska potentialen för den bivalenta läkemedelskonstruktionen utvärderades. Vi fann att den bivalenta ZHER3- ABD-ZHER3-mcDM1 är ett mycket potent läkemedelskonjugat med gynnsam biodistribution och antitumöreffekt. Dessa resultat tyder på att ZHER3-ABD-ZHER3- mcDM1 är lovande för framtida klinisk utveckling som ett potentiellt terapeutiskt alternativ för patienter med HER3-överuttryckande cancer. 

Sammanfattningsvis visar avhandlingen att modifiering och optimering av olika komponenter inom HER2- och HER3-inriktade affibody-läkemedelskonjugat kan förbättra den terapeutiska effektiviteten avsevärt, och resultaten uppmuntrar därigenom till ytterligare utveckling av riktade läkemedelskonjugat.