Enzymes are natures catalysts that increase the rate of a chemical reaction. The increased rate of a reaction is required to be able to sustain life. Despite the huge impact of enzymes, they are not perfect catalysts. Enzyme and protein engineering is the discipline in which proteins are characterized and engineered to have improved inherent properties. Interesting properties of an enzyme to improve include stability and activity. The aim of this work is to understand how proteins and enzymes function and use a variety of different protein engineering techniques to enhance the properties of different proteins. In this work proteins and enzymes are engineered to increase our knowledge of the target proteins for downstream biomedical applications. A mix between rational and semi-rational engineering is applied in this work. In paper I and paper II, the method used is ancestral sequence reconstruction. A method that utilizes the evolutionary relationship between homologous sequences. In paper I the method was applied to a terpene cyclase, which cyclizes a precursor terpene into potential interesting drug leads. The result was a hyperstable enzyme variant. In paper II the technique was applied to the SARS-CoV-2 Spike protein. The protein is responsible for the virus SARS-CoV-2 to enter human cells. The work yielded a stable spike protein that readily expresses and can be utilized as a vaccine lead. In paper III, the aim was to understand human oxidosqualene cyclase (hOSC). A terpene cyclase essential in cholesterol synthesis. The enzyme hOSC was rationally engineered to change the driving force of the reaction. Through targeted mutations the reaction changed from entropy driven to enthalpy driven. Finally, in paper IV, a rationally engineered PETase, which is capable of degrading PET polymers into monomers, was proven to be active in human serum and verifies the proof-of-concept of degrading plastic in human blood. To summarize, the results in this thesis show the applicability of different enzyme engineering techniques to stabilize or change the function of proteins and the potential of engineered proteins in medical applications.

Enzymer är naturens katalysatorer vilka höjer hastigheten av kemiska reaktioner. En ökad hastighet av en reaktion är nödvändig för att upprätthålla liv. Trots enzymers och proteiners stora påverkan på reaktionshastigheter så är de inte perfekta katalysatorer. Enzym- och proteindesign är en vetenskap där enzymer och proteiner karaktäriseras och designas för att förbättra vissa egenskaper hos dem. Egenskaper hos enzymer så som stabilitet och aktivitet är intressanta att förbättra. Syftet med det här arbetet är att förstå hur proteiner och enzymer fungerar, samt deras egenskaper för olika applikationer i ett senare skede, exempelvis inom biomedicin. En blandning av rationell och semi-rationell enzym- och proteindesign används i det här arbetet. I artikel I och II används metoden ancestral sekvensrekonstruering. Metoden nyttjar de evolutionära sambanden mellan homologa sekvenser. I artikel I användes metoden på ett terpencyklas, ett enzym som skapar ringstrukturer hos en terpenföregångare, vilket resulterar i molekyler som kan vara intressanta för användning i läkemedel. Resultatet blev en hyperstabil enzymvariant. I artikel II användes metoden på SARS-CoV-2 Spike protein. Proteinet är ansvarigt för att viruset SARS-CoV-2 kan ta sig in i mänskliga celler. Arbetet resulterade i ett stabilt spike protein som lätt uttrycks med potentiell användning i vaccintillverkning. I artikel III var syftet att förstå humant oxidoskvalencyklas (hOSC). hOSC är ett terpencyklas som är nödvändig i syntesen av kolesterol. Enzymet designades för att ändra den drivande kraften hos reaktionen. Genom riktade mutationer ändrades reaktionen från att vara entropidriven till att vara entalpidriven. Slutligen, i artikel IV visades hur ett designat PETase, som bryter ned PET polymerer till monomerer, är aktivt i mänskligt serum och bekräftar att nedbrytning av plast i mänskligt blod är möjligt. Sammanfattningsvis, resultaten i den här avhandlingen visar hur olika enzymdesignstekniker kan appliceras för att stabilisera eller ändra funktioner hos proteiner och potentialen av designade enzymer i medicinska applikationer.

The development of a carbon-based bioeconomy for synthesis and degradation of polymers has gained importance over the years. Research efforts have been made to develop green routes to produce bio-based material from biomass as well as environmentally friendly ways to synthesize and degrade polymers. Enzymes are biocatalysts that are capable of performing reactions beyond their intended purpose. The work presented in this thesis focused on using biocatalysts for novel reactions to produce bio-plastics as well as degrade synthetic polymers. In Paper I, a decarboxylase was used to perform the fixation of CO₂ under mild conditions to produce the platform chemical 2,5-furandicarboxylic acid (FDCA). In Paper II, a closed-loop approach for the production of bio-based polyesters and their enzymatic degradation was investigated. Moreover, the difference of catalytic activity towards different polymer conformations was noted and further investigated in Paper III. Here, the conformational landscape to match enzyme to substrate was explored. The model substrate for this project was post-consumer PET bottles since is one of the most used polymer worldwide. The substrate conformation affected the catalytic activity of the enzymes significantly hence, in Paper IV, the physical and chemical characteristics of various PET-based substrates was investigated to better understand the factors that will yield a high reaction efficiency for polymer depolymerization. Finally, the results obtained so far were used in Paper V to show that plastic degrading enzymes can be used for microplastic degradation in human blood as a proof-of-concept. In summary, the work in this thesis showed the potential of using enzymes as catalysts for the production of platform chemicals through CO₂ fixation and for polymer degradation initiating an attractive path to close the loop in a bio-economy for polymer materials.

Utvecklingen av en kolbaserad bioekonomi för syntes och återvinning av polymerer har blivit allt viktigare under åren. Forskningsinsatser har genomförts för att utveckla grönare alternativ för att producera biobaserade material samt miljövänliga sätt att syntetisera och bryta ner polymerer. Enzymer är biokatalysatorer som kan utföra reaktioner utöver deras avsedda syfte. Arbetet som presenteras i denna avhandling fokuserade på att använda biokatalysatorer för nya reaktioner för att producera bioplaster och bryta ner syntetiska polymerer. I Artikel I användes ett dekarboxylas för att fixera CO₂ under milda förhållanden för att producera plattformskemikalien 2,5-furandikarboxylsyra (FDCA). I Artikel II undersöktes en sluten loop-metod för produktion av biobaserade polyester och deras enzymatiska nedbrytning. Dessutom noterades skillnaden i katalytisk aktivitet mot olika polymerkonformationer och undersöktes vidare i Artikel III. Här studerades det konformationella landskapet för att matcha enzym mot substrat. Modellsubstratet för detta projekt var PET-flaskor eftersom det är den mest använda polymeren världen över. Substratkonformationen påverkade enzymernas katalytiska aktivitet signifikant, varför de fysikaliska och kemiska egenskaperna hos olika PET-baserade substrat undersöktes i Artikel IV för att bättre förstå de faktorer som ger en hög reaktionseffektivitet för depolymerisering. Slutligen användes de hittills erhållna resultaten i Artikel V för att visa att plastnedbrytande enzymer kan användas för nedbrytning av mikroplast i humanblod som en proof-of-concept. Sammanfattningsvis visade arbetet i denna avhandling potentialen att använda enzymer som katalysatorer för produktion av plattformskemikalier genom CO₂ -fixering och för polymernedbrytning vilket initierar en attraktiv väg för att sluta kretsloppet i en bioekonomi för polymera material.