Enkelsträngade oligonukleotider fungerar som viktiga forskningsverktyg. Vanliga oligonukleotider har dock många begränsningar, såsom begränsade funktionaliteter, mindre stabilitet och reducerade halveringstider i både in vivo och in vitro system. Modifiering av oligonukleotider fungerar som ett attraktivt sätt att förbättra alla dessa egenskaper och anmärkningsvärt utöka alla egenskaper som hämmas av vanliga oligonukleotider. 

Den "monoklonala stökiometriska (MOSIC)"-metoden har använts av "Moligo Technologies" för enzymmedierad snabb DNA-oligonukleotidproduktion. Denna enzymbaserade metod möjliggör syntes av mycket långa och exakta oligonukleotider. Syftet med detta projekt var att bredda denna plattform för att utföra syntes av enkelsträngade oligonukleotider som hyser modifierade nukleotider. Två modifierade nukleotider användes för att tjäna som ersättningar för två olika vanliga deoxinukleotidtrifosfater. Dessutom användes de modifierade nukleotiderna i olika procentsatser i det enkelsträngade DNA:t. Den enkelsträngade DNA-syntesplattformen involverade i vitro rullande cirkelamplifiering av oligonukleotider från klonala mallar som härrör från enkla bakteriekolonier, följt av deras nedbrytning som underlättades av hårnålar. Resultatet var frisättningen av pooler av enkelsträngade oligonukleotider. Att testa olika reaktionsförhållanden, särskilt med fokus på optimering av rullande cirkelförstärknings- och uppslutningsstegen, har varit huvudfokus i denna studie. 

Ett optimerat arbetsprotokoll för att syntetisera enkelsträngat DNA innehållande de modifierade nukleotiderna i olika procentsatser etablerades således. Det syntetiserade enkelsträngade DNA:t med förbättrade funktionaliteter tack vare de modifierade nukleotiderna förväntas tjäna de olika terapeutiska tillämpningarna överlägset jämfört med det vanliga DNA:t. 

Single stranded oligonucleotides serve as important research tools. Regular oligonucleotides however have many limitations, like limited functionalities, less stability and reduced half lives in both in vivo and in vitro systems. Modifying oligonucleotides serves as an attractive way to improve all these features and remarkably expand on all the properties inhibited by regular oligonucleotides. 

The ‘monoclonal stoichiometric (MOSIC)’ method has been in use by ‘Moligo Technologies’ for enzyme mediated rapid DNA oligonucleotide production. This enzyme-based method enables the synthesis of very long and precise oligonucleotides. the aim of this project was to broaden this platform to perform synthesis of single stranded oligonucleotides harboring modified nucleotides. Two modified nucleotides were used to serve as replacements of two different regular deoxynucleotide triphosphates. Moreover, the modified nucleotides were used in different percentages in the single-stranded DNA. The single-stranded DNA synthesis platform involved in vitro rolling circle amplification of oligonucleotides from clonal templates that are derived from single bacterial colonies, followed by their digestion that was facilitated by cutter hairpins. The result was the release of pools of single stranded oligonucleotides. testing different reaction conditions especially focusing on the optimization of the rolling circle amplification and digestion steps has been the major focus of this study. 

An optimized working protocol for synthesizing single stranded DNA containing the modified nucleotides in different percentages was thus established. The synthesized single stranded DNA with improved functionalities owing to the modified nucleotides is expected to superiorly serve the various therapeutic applications than compared to the regular DNA.