Typ 2-diabetes (T2D) har visat sig orsaka hjärt- och kärlsjukdomar (CVD), med ateroskleros och kranskärlssjukdom (CAD) ofta förknippade med T2D. Hos individer med T2D genomgår röda blodkroppar (RBC) funktionella förändringar som orsakar minskad NO-biotillgänglighet och ökad oxidativ stress genom bildning av reaktiva syreämnen (ROS), vilket i sin tur orsakar endoteldysfunktion. Vidare kan RBC kommunicera med andra celler, såsom endotelceller, via extracellulära vesiklar (EV) som innehåller bioaktiva molekyler. Detta har lett till att EV fått uppmärksamhet som potentiella mediatorer av CVD i T2D. Endotelkväveoxidsyntas (eNOS) vägen är väsentlig för NO-produktion men i T2D blir eNOS dysfunktionellt, vilket bidrar till produktionen av oxidativ stress. NADPH Oxidas (NOX) enzymer genererar reaktiva syrearter som inducerar endoteldysfunktion; ändå är NOX isoformernas roll i T2D komplex och inte helt förstådd. Syftet med detta projekt var att undersöka och identifiera de molekylära signaleringsmekanismer genom vilka RBC-härledda EV inducerar endoteldysfunktion i T2D. Humana blodprover från välkarakteriserade T2D-patienter och friska kontrollkohorter användes för RBC-isolering och EVinsamling. Effekten av EV härledda från T2D-RBC (T2D-RBC EV) bedömdes genom immunhistokemi och myografstudier, där aortor från vildtypshanmöss (C57BL/6) isolerades och användes. RNAsekvensering användes för att identifiera differentiellt uttryckta gener och vägar. Humana karotisartärendotelceller (HCtAEC) användes för in vitro-studier, för undersökning av cellviabilitet och saminkubation med T2D-RBC EV och friska (H)-RBC EV. Immunhistokemi med oxidativ stressmarkörer (4-HNE, fosfo-eNOS och nitrotyrosin) avslöjade förhöjt uttryck i aortor inkuberade med T2D-RBC EV. qPCR-analys visade en signifikant ökning av NOX4- mRNA-nivåer i HCtAEC saminkuberade med T2D-RBC EV medan NOX1, eNOS och PTP1B uttryck förblev oförändrat. Myografstudier visade endoteldysfunktion som räddades genom administrering av oxidativ stresshämmare NAC till aortorna i organkamrarna. RNA-Seq identifierade 26 differentiellt uttryckta gener, med TBC1D25 och SLC35B2 potentiellt kopplade till T2D patofysiologi. Validering av RNA-Seq-resultaten visade inga skillnader i uttrycksnivåer, vilket tyder på att RNA-Seq-resultaten kanske inte är tillförlitliga. Inhibering av NOX2/4 med hjälp av inhibitor GLX481304 visade sig vara toxisk för aortan. Som slutsats kunde vi konstatera att T2D-RBC EV indirekt inducerar endoteldysfunktion genom ökad oxidativ stress.

Type 2 Diabetes (T2D) has been shown to cause cardiovascular diseases (CVDs), with atherosclerosis and coronary artery disease (CAD) being commonly associated with T2D. In T2D, red blood cells (RBCs) undergo functional alterations, causing reduced NO bioavailability and increased oxidative stress through the formation of reactive oxygen species (ROS), in turn causing endothelial dysfunction. Further, RBCs can communicate with other cells, such as endothelial cells, via extracellular vesicles (EVs), which contain bioactive molecules. This has caused EVs to gain attention as potential mediators of CVDs in T2D. The endothelial nitric oxide synthase (eNOS) pathway is crucial to produce NO; however, in T2D, eNOS becomes uncoupled and, thereby contribute to the production of ROS. Similarly, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) Oxidase (NOX) enzymes generate ROS that induce endothelial dysfunction; nevertheless, the role of NOX isoforms in T2D is complex and not fully understood. This thesis project aimed to investigate and identify the molecular signaling mechanisms by which RBC derived EVs induce endothelial dysfunction in T2D. Human blood samples from well-characterized T2D patients and healthy control cohorts were utilized for RBC isolation and EV collection. The impact of EVs derived from T2D-RBCs (T2D-RBCs EVs) was assessed through immunohistochemistry and wire myograph studies, where aortas from male wild-type mice (C57BL/6) were isolated and used. RNA sequencing was used to identify differentially expressed genes and pathways. Human carotid artery endothelial cells (HCtAEC) were used for in vitro studies, examining cell viability and co-incubation with T2D-RBCs EVs and healthy (H)-RBCs EVs. Immunohistochemical staining using oxidative stress markers (4-HNE, phospho-eNOS, and nitrotyrosine) revealed elevated expression in aortas incubated with T2D-RBCs EVs. qPCR analysis showed a significant increase in NOX4 mRNA levels in HCtAEC co-incubated with T2D-RBCs EVs while NOX1, eNOS, and PTP1B expression remained unchanged. Wire myograph studies demonstrated that the endothelial dysfunction caused by T2D-RBCs EVs was rescued by the administration of oxidative stress inhibitor NAC to the aortas in the organ chambers. RNA-Seq identified 26 differentially expressed genes, with TBC1D25 and SLC35B2 potentially linked to T2D. Validation of the RNA-Seq results showed no differences in expression levels, suggesting that the RNA-Seq results may not be reliable. Inhibition of NOX2/4 using inhibitor GLX481304 was found to be toxic for the aortas. As a conclusion, we could state that T2D-RBCs EVs indirectly induce endothelial dysfunction through increased vascular oxidative stress.