Enzym-X är ett industriellt relevant enzym som används i biokatalytiska processer för produktion av ämnet A4 från Cysbio. Produktionskapaciteten av denna process är för tillfället begränsat av ett problem som uppstår vid överuttryck av rekombinanta proteiner i E. coli (värdorganism för produktion av enzym-X), nämligen bildandet av inklusionskroppar, d.v.s. aggregering av missveckade proteiner. I ett försök att förbättra produktionskapaciteten genom att öka lösligheten och/eller utbytet av enzym-X, undersökte detta projekt följande: 1) effekten av tillväxtmediets komposition (genom ett DoE upplägg), 2) samuttryck av anaplerotiska enzymet pyruvatkarboxylas (PYC), 3) samuttryck av chaperoner, 4) uttryck av enzym-X med hjälp av olika promotorer.

De konstruerade stammarna växtes i skakflaskor i ett tillväxtmedium designat i detta projekt. Trots att ingen av dem överträffade nuvarande produktionsstam i denna kontext, demonstrerade några intressanta stammar förbättrat utbyte av biomassa vid en viss nivå av PYC samuttryck, inblandning av GroELS chaperon-systemet i veckningen av enzym-X, och potentialen av den strängt reglerade tetracyklin promotorn i ersättandet av den nuvarande, läckande och dyra T7 promotorn. På grund av att SF-baserad undersökning är opålitlig i differentiering mellan kontroll och bättre presterande stammar, rekommenderas komplementär bedömning i fed-batch fermentationer då alla positiva svar kan översättas till reduktion i produktionskostnad av ämnet A4. Vidare undersökning är rekommenderat för att finjustera induceringen av de testade promotorerna och samuttryck av PYC och GroELS.

Enzyme-X is an industrially relevant enzyme utilized in a biocatalytic process for production of compound A4 by Cysbio. Currently, the production capacity of this process is limited by an issue commonly encountered when overexpressing recombinant proteins in E. coli (expression host of enzyme-X), namely the formation of inclusion bodies, i.e. aggregations of misfolded proteins. In an effort to improve production capacity by increasing enzyme-X solubility and/or yield, this project investigated the following: 1) effects of growth media composition (utilizing a DoE setup), 2) co-expression of anaplerotic enzyme pyruvate carboxylase (PYC), 3) co-expression of chaperones 4) expression of enzyme-X by different promoters.

The constructed strains were grown in shake flasks using a growth medium designed in this project.  Despite none of them outperforming the current production strain in this context, some interesting strains were identified demonstrating improved biomass yield upon certain level of PYC co-expression, involvement of GroELS chaperone system in folding of enzyme-X and the potential of the tighly-regulated tetracycline promoter in replacing the currently used, leaky and costly T7 promoter. Due to shake flask based screening being unreliable for differentiating better-performing strains from control, complementary assessment in a fed-batch fermentation setup is recommended, as any positive hits could be translated to reduction of production cost of compound A4. Lastly, further investigation is recommended to fine-tune induction of the tested promoters and co-expression of PYC and GroELS.