Den fortsatta användningen av fossila bränslen och de resulterande utsläppen av växthusgaser påverkar miljön negativt och bidrar till den globala uppvärmningen. Detta gör de nödvändigt att skapa alternativa hållbara bränslen som kan konkurrera på marknaden mot fossila bränslen. Upptäckten/Utvecklingen av organismen Acetivibrio thermocellus, en termofil bakterie som kan möjliggöra ”consolidated bioprocessing” av material som lignocellulosa till andra generationens biobränslen, gör det potentiellt möjligt att konkurrera med industrin av fossila bränslen. A. thermocellus nuvarande förmåga att producera etanol är för låg för att konkurrera med industrin av fossila bränslen och ytterligare kunskap om organismens metabolism krävs för att motverka detta. En utveckling för tillväxt av A. thermocellus på anda kolkällor än cellodextriner skulle kunna möjliggöra forskning som expanderar kunskapen om orgnaismens metabolism. Denna studie fokuserar på konstruktion av bakteriestammar för A. thermocellus som möjliggör tillväxt på dessa alternativa kolkällor. Till en början var heterologa enzymer som, åtminstone stökiometriskt, kunde möjliggöra användning av dessa alternativa kolkällor funktionellt annoterade vilket bekräftade närvaron av aktiva enzymer i det första steget av den enzymatiska reaktionen. Det andra steget av den enzymatiska reaktionen som undersöktes uppvisade emellertid endast aktivitet för ett enzym av de testade. Enzymer med bekräftad aktivitet placerades på plasmider och transformerades in i A. thermocellus för att undersöka tillväxt på de alternativa kolkällorna. Tyvärr var bara transformationerna framgångsrik med A. thermocellus nativa enzymer med undantaget av ett annat enzym. Slutligen, med de konstruerade stammarna av A. thermocellus, testades tillväxt på de alternativa kolkällorna med användning av medium innehållande olika supplement som potentiellt skulle kunna lindra olika tillväxtdefekter. Tyvärr kunde ingen av de konstruerade stammarna konsumera de alternativa kolkällorna. För att undersöka bristen på tillväxt upprepades funktionell annotering för enzymerna uttryckta i de konstruerade A. thermocellus stammarna. Intressant nog uppvisade ingen stam ett funktionellt enzym i steg 1 och endast ett enzym i steg 2, nativt för A. thermocellus, var funktionellt. Dessutom utfördes PCR och Sanger-sekvensanalys på en konstruerad stam för att klarlägga avsaknaden av konsumtion på de alternativa kolkällorna. Data indikerade att det höga uttrycket av aktiva enzymer kan vara toxiskt för A. thermocellus då mutationer detekterades i de uttryckta generna.

The continued use of fossil-based fuels negatively affects the environment and contributes to global warming due to the release of greenhouse gases. This creates the need for alternative sustainable fuels that can compete in the market against fossil-based fuels. The emergence of the organism Acetivibrio thermocellus, a thermophilic bacterium that could allow for consolidated bioprocessing of lignocellulosic feedstocks to second-generation biofuels, makes it potentially possible to compete with fossil-based fuels. However, current ethanol production capabilities of A. thermocellus are below the industrial requirements and require additional knowledge of the metabolism. To aid such research efforts, growth of A. thermocellus on carbon sources other than cellodextrins would be useful. This study focuses on engineering A. thermocellus to allow for growth on alternative carbon sources. First, heterologous enzymes that at least stoichiometrically enable to use of these alternative carbon sources were functionally annotated and confirmed the presence of active enzymes for the 1st step of the pathway. However, for the second pathway step only one enzyme exhibited activity. Enzymes with confirmed activity were placed on expression plasmids and transformed to A. thermocellus to investigate growth on the alternative carbon sources. Unfortunately, transformation events were only successful with the native A. thermocellus pathway and one other transformation round. Finally, with the constructed strains of A. thermocellus, growth on the alternative carbon sources was tested using media containing various supplements that could potentially alleviate various growth defects. None of the constructed strains was able to consume the alternative carbon sources. To investigate the lack of growth, functional annotation was repeated for enzymes expressed in the constructed A. thermocellus strains. Interestingly, no strain exhibited a functional enzyme for step 1 and only one enzyme for step 2 native to A. thermocellus was functional. Furthermore, one constructed strain was run through PCR and Sanger sequencing analysis to elucidate the lack of alternative carbon source consumption. Data indicated that the high enzyme expression might be toxic for A. thermocellus due to mutations detected in the expressed genes.