Osimertinib är ett läkemedel som används för att behandla icke-småcellig lungcancer (NSCLC). Preparatet tillhör den tredje generationen av tyrosinkinashämmare (TKI) och har som mål en tillväxtfaktorrecep-tor, EGFR (epidermal growth factor receptor), som finns muterad och konstitutivtaktiv hos ca 10–20% av alla NSCLC tumörer. Osimertinib kan effektivt inhibera receptorer som uttrycker flera olika EGFR mutationer associerade med dåligt behandlingssvar gentemot preparat tillhörande den första- eller andra generationens EGFR TKIs. Behandlingseffekten av osimertinib påverkas dock av ytterligare förvärvade genetiska och signaltransduktions-relaterade förändringar hos tumören som kan leda till resistens. Då NSCLC tumörer är svåra att ta prov från och metastaserna är heterogena i sina proliferativa signaler finns det ett stort behov av att utveckla en icke-invasiv vätskebiopsi-baserad metod för att möjliggöra mätning av patientens behandlingssvar. Extracellulära vesiklar (EVs) har föreslagits som en potentiell källa för sådana biomarkörer. Denna masteruppsats syftar till att undersöka uttrycket av några ytproteiner på EVs från NSCLC celler som är känsliga eller resistenta mot osimertinib, och därefter utvärdera om dessa proteiner är möjliga biomarkörer för analys av EVs extraherade ur patientens blod innan och under terapi.

EVs från två NSCLC cellinjer med aktiverande EGFR-mutationer undersöktes i detta projekt. Proverna isolerades från cellkulturerna genom gelfiltrering (SEC) både innan och efter det att cellerna behandlats med osimertinib. EV-partiklarna analyserades med avseende på storlek och antal med nanoparticle tracking analys (NTA). Masspektrometri (MS) hade tidigare applicerats för att studera det totala proteinuttrycket hos EVs och genom bioinformatiska metoder identifierades proteiner vars differentiella uttryck kunde kopplas till osimertinib-resistens. Uttrycket av proteinerna tetraspanin-28 (CD81), protein x1, protein x2, protein x3 var på högre uttryckta i EVs från den osimertnib resistenta cellinjen, medan protein x4 hade ett lägre uttryck än i den behandlings-känsliga cellinjen.

Fluorescensmikroskopi (FL mikroskopi) användes för att vidare undersöka uttrycket av CD81, protein x4, protein x1, protein x2 på ytan av vesiklarna. Resultatet visade att samtliga protein var uttryckta. Alla proteiner hade ett lägre uttryck i de vesiklar som isolerats från den resistenta cellinjen jämfört med den responsiva. Dock hade protein x2 och CD81 ett ökat genomsnittligt uttryck per vesikel i prover från den resistenta cellinjen.

Även om det återstår att förklara skillnaderna observerade mellan de två metoderna så har den FL-baserade metoden för att mäta proteinuttryck på vesiklarnas yta bidragit med nya fakta gällande protein-proteinsamlokalisering och proteinuttryck för vesiklarna på en individuell nivå. Proteinerna protein x1, protein x2, protein x4 och CD81 är därmed relevanta kandidater i utvecklandet av en icke-invasiv vätskebiopsi-baserad metod för monitoreringen av osimertinib resistens. Studier har redan inletts i syftet att kartlägga proteinuttrycket på vesiklar isolerade från serumprover från NSCLC patienter för utvecklandet av en sådan metod.

The 3rd -generation epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor (TKI) osimertinib has significantly improved the clinical management of patients with non-small cell lung cancer (NSCLC). Although osimertinib can target several of the mutations with the EGFR linked to refractoriness to early generation EGFR TKIs, treatment responses are heterogeneous, and resistance inevitably develops. The challenges in monitoring heterogeneity in treatment response have created a demand for non-invasive liquid biopsy-based methods. This study aims to evaluate if the membrane proteins of tumor released extracellular vesicles (EVs) are relevant biomarkers for such applications.

Two NSCLC cell lines with mutant EGFR were used to isolate EVs prior and post osimertinib exposure by size exclusion chromatography (SEC). One of the cell lines was responsive to treatment with osimertinib and the other was made to be resistant in vitro. Size- and concentration assessment of the isolated EVs were performed by nanoparticles tracking analysis (NTA). Earlier mass spectrometry (MS) of the total EV proteome identified several proteins in EVs associated with osimertinib refractoriness, including Tetraspanin-28 (CD81), protein x1, protein x2, protein x3 and protein x4. These proteins were found to be significantly upregulated in the EVs isolated from the osimertinib refractory cell line. Alterations in EGFR expression was also observed upon osimertinib resistance development. The expression of EGFR was further found to increase in EVs released from H1975 cells after exposure to osimertinib.

In this work, the abundance and expression levels of a handful of the identified proteins were analyzed on a single-EV level by applying a fluorescence (FL) microscopy-based method. Protein x4, CD81, protein x1 and protein x2 were all identified on the surface of the EVs when examined by FL microscopy. In contrast to the results presented by MS, the EVs isolated from the osimertinib refractory cell line showed an overall decreased expression of all the examined proteins. CD81 and protein x2 expression did however increase when examining the average expression level per vesicle.

What contributed to these differences in results between the two methods cannot as of now be concluded. The FL-based method has given new insight into protein colocalization and expression levels on a single-EV level. Although the FL-based method failed to identify overall increased expression levels on the surface of EVs isolated from the refractory cell line, CD81, protein x1, protein x2 and protein x3 are still relevant to further study in the context of osimertinib refractoriness in NSCLC. Studies are already ongoing aimed to investigate the expression profiles of EVs released into serum of patients with a NSCLC tumor in the quest to develop an assay able to monitor refractoriness to osimertinib.