Change search
CiteExportLink to record
Permanent link

Direct link
Cite
Citation style
  • apa
  • harvard1
  • ieee
  • modern-language-association-8th-edition
  • vancouver
  • Other style
More styles
Language
  • de-DE
  • en-GB
  • en-US
  • fi-FI
  • nn-NO
  • nn-NB
  • sv-SE
  • Other locale
More languages
Output format
  • html
  • text
  • asciidoc
  • rtf
Structural elucidation of mRNA(Sirt1)-microRNA 34a complex
KTH, School of Education and Communication in Engineering Science (ECE).
2015 (English)Independent thesis Advanced level (degree of Master (Two Years)), 20 credits / 30 HE creditsStudent thesis
Abstract [en]

The aim of this thesis is to understand RNA-RNA interactions steering cellular functions, as in the case of this thesis the structure of mRNA(Sirt1) in complex with microRNA-34a (miR-34a). MiR-34a regulates the cancer protein p53 via Sirt1 modulation. This work will be the basis for future drug design and the understanding of misguided regulation in cancer.

The miR-34a binds to the mRNA(Sirt1) 3’ untranslated region (3’-UTR) and will either inhibit the translation of the protein Sirtuin 1 by capturing its mRNA or by degrading it. p53, a key activator of miR-34a, prevents cancer development by inducing programmed cell death (apoptosis) on cells with DNA damage. In contrast, the protein Sirtuin 1 (Sirt1) has been shown to help cells with DNA damage to survive by down regulating the activity of protein p53 and will therefore increase the risk of cancer development. Studying the interaction between the mRNA(Sirt1) and miR-34a can present valuable information on the structure of the complex as well as the mode miR-34a uses to inhibit translation of mRNA(Sirt1) leading to down regulation of protein Sirtuin 1 and therefore prevent cancer development.

For the elucidation of this question different biochemical and biophysical methods were applied, such as in vitro transcription, gel electrophoresis, RNA purification with gel, crush & soak and Cicular Dichroism (CD) melting studies. For this thesis work, the target sequence in mRNA(Sirt1) was optimized and purified so melting studies could be carried out. For future structural characterization using Nuclear Magnetic Resonance (NMR) studies with the miR-34a also produced in the lab.

The mRNA(Sirt1) target sequence was produced and purified with the final yield of 0.02%. The results show that the sequence is highly ATP dependent and suggest the ratio between the nucleotides ATP/CTP to be 1:2. Low yield of purified mRNA(Sirt1) was received and still contained some impurities, which imply that another method than crush & soak should be used when purifying. The results, indicate that High-Preformance Liquid Chromatography (HPLC) might be a better solution for the pufication process.

The melting profiles done on mRNA(Sirt1) show that the secondary structures decrease with an increase in temperature. Accroding to the results, the mRNA(Sirt1) sequence is folded in room temperature, though not very stable. The wavelength which provided the best resolution was at 268 nm and the melting point of mRNA(Sirt1) was determined to 44 °C. This thesis also contains an educational part, where an educational material was provided and testing was conducted for the subject Chemistry 2 for students age 18 and the material was evaluated with qualitative methods together with pedagogical methods. The study showed that the student can develope the different abilities stated in the curriculum with the material created. The results also showed that the students preferably choose cultural arguments when dicussing socio scientific question, rather than economical, democratic or utility arguments.

Abstract [sv]

Syftet med studien är att förstå RNA-RNAinteraktioner som styr cellulära funktioner, i detta fall mRNA(Sirt1) i komplex med microRNA-34a (miR-34a). MiR-34a reglerar cancerproteinet p53 via modulation av Sirt1. Detta arbete kommer lägga grund för framtida läkemedelsdesign vid reglering av cancer.

MiR-34a binder till den 3’ otranslerade regionen i mRNA(Sirt1) och hämmar antingen translationen av protein Sirtuin 1 (Sirt1) genom att fånga dess mRNA eller genom att försämra det. p53 förhindrar utvecklingen av cancer genom att framkalla programmerad cell död (apoptosis) av celler med skadat DNA. Det har visats att proteinet Sirtuin 1 hjälper celler med skadat DNA att överleva, genom att sänka aktiviteten av p53. På så vis ökar risken för utveckling av cancer. Genom att studera interaktionen mellan mRNA(Sirt1) och miR-34a kan värdefull information kring komplexets struktur fås. Samt hur miR-34a hämmar translationen av mRNA(Sirt1), vilket leder till minskad aktivitet av protein Sirt1.

För att klarlägga denna fråga har olika biokemiska och biofysiska metoder använts, såsom in vitro transkription, gelelektrofores, RNA rening med gel och Circular Dichroism (CD). För detta arbete har målsekvensen i mRNA(Sirt1) optimerats och renats så CD smältstudier med kunde genomföras.

Resultatet visar att mRNA(Sirt1) sekvensen renats med ett utbyte på 0.02 %. Sekvensen är beroende av ATP och förhållandet mellan ATP/CTP nukleotider bör vara 1:2. Resutatet visar på ett lågt utbyte som visar på att High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) kan vara en bättre metod än Crush & soak för reningen av mRNA(Sirt1).

Ur de smältprofiler som gjorts visade det sig att de sekundära strukturerna av mRNA(Sirt1) minskade med ökande temperatur. I enlighet med resultaten visar det att mRNA(Sirt1) är veckat i rumstemperatur men är inte stabil. Den bästa upplösningen erhölls vid 268 nm och mRNA(Sirt1) har en smältpunkt runt 44 °C.

Detta arbete innehåller även ett utbildningskapitel, där ett utbildningsmaterial har skapats och testats på 18-åriga kemi 2 studenter i åldern 18 år. Materialet har utvärderats med hjälp av kvalitativa metoder tillsammans med pedagogiska metoder.

Studien visade att de flesta förmågorna för kemi 2 kan utvecklas med hjälp av denna typ samhällsfrågor i det naturvetenskapliga klassrummet (SNI-fall) förutom förmågan att planera och genomföra experiment. Det argument som eleverna helst väljer att använda då de diskuterar det skapade SNI-fallet är Kulturargument och det minst använda är Demikratiargument.

Place, publisher, year, edition, pages
2015. , 71 p.
Keyword [en]
mRNA(Sirt1), miR-34a, in vitro transcription, gel electrophoresis, CD spectroscopy, NMR, cancer regulation via p53, HPLC
Keyword [sv]
mRNA(Sirt1), miR-34a, in vitro transkription, gel elektroforesis, CD spektroskopi, NMR, cancer regulering via p53, HPLC
National Category
Chemical Sciences
Identifiers
URN: urn:nbn:se:kth:diva-168623OAI: oai:DiVA.org:kth-168623DiVA: diva2:817586
External cooperation
Karolinska Institutet, Stockholms Universitet
Educational program
Master of Science in Engineering - Engineering and of Education
Supervisors
Examiners
Available from: 2015-06-05 Created: 2015-06-05 Last updated: 2015-06-05Bibliographically approved

Open Access in DiVA

fulltext(6969 kB)151 downloads
File information
File name FULLTEXT01.pdfFile size 6969 kBChecksum SHA-512
ca7845e98e2476a49779a17c13ca7e4dde8b004b214f34bddd8f00866116fbd42281f03f668f5e76a07e51af96a06629107103b5491d7f485cd76a1ac86d7d22
Type fulltextMimetype application/pdf

By organisation
School of Education and Communication in Engineering Science (ECE)
Chemical Sciences

Search outside of DiVA

GoogleGoogle Scholar
Total: 151 downloads
The number of downloads is the sum of all downloads of full texts. It may include eg previous versions that are now no longer available

urn-nbn

Altmetric score

urn-nbn
Total: 334 hits
CiteExportLink to record
Permanent link

Direct link
Cite
Citation style
  • apa
  • harvard1
  • ieee
  • modern-language-association-8th-edition
  • vancouver
  • Other style
More styles
Language
  • de-DE
  • en-GB
  • en-US
  • fi-FI
  • nn-NO
  • nn-NB
  • sv-SE
  • Other locale
More languages
Output format
  • html
  • text
  • asciidoc
  • rtf