Change search
CiteExportLink to record
Permanent link

Direct link
Cite
Citation style
  • apa
  • harvard1
  • ieee
  • modern-language-association-8th-edition
  • vancouver
  • Other style
More styles
Language
  • de-DE
  • en-GB
  • en-US
  • fi-FI
  • nn-NO
  • nn-NB
  • sv-SE
  • Other locale
More languages
Output format
  • html
  • text
  • asciidoc
  • rtf
Secondary Structure of Protamine Monitored by Raman Optical Activity
KTH, School of Chemical Science and Engineering (CHE).
2015 (English)Independent thesis Advanced level (degree of Master (Two Years)), 20 credits / 30 HE creditsStudent thesisAlternative title
Studie av sekundärstrukturen i protamin med Raman optisk aktivitet(ROA) (Swedish)
Abstract [sv]

Protaminer är små, nukleära och basiska proteiner vilka syntetiseras inuti spermatiderna under utvecklingsprocessens slutskede med funktionen att packa DNA i kompakta komplex. Den fullständiga biologiska funktionen är dock ännu inte fastställd. Både primär- och sekundärstrukturen varierar mellan arter och den fortfarande okända sekundärstrukturen hos protamin från lax undersöks i denna studie.  Med tillämpning av Raman Optical Activity (ROA) kan de strukturella detaljerna studeras hos det lösta proteinet, vilket varit svårt med andra tekniker. Kombinationen av känslighet för kiralitet på molekylära vibrationsnivåer och möjligheten att analysera prov direkt i lösning gör ROA till en ytterst passande teknik för att studera flexibla proteinstrukturer som protamin. Projektet inleddes med omkonstruktion av det icke-kommersiella ICP-ROA-instrumentet (Incident Circular Polarization) i ett försök att öka den optiska genomströmningen och erhålla renare spektra med mindre artefakter. De instrumentella förändringarna omfattade bland annat en ny spektrografdesign och den kommersiella spektrografens kameralins byttes mot en dubbel akromatisk lins med fokallängden 200 mm. Instrumentets optik justerades steg för steg till optimalt läge. Verkningsgraden ökade med 20 % och spektrala artefakter minskades signifikant.

Enligt ROA-spektra antar löst protamin en huvudsakligen oregelbunden sekundärstruktur med små inslag av a-helix. En orsak till den strukturella oregelbundenheten kan vara de täta argininklustren som resulterar i många positivt laddade sidokedjor på proteinkedjan, vilka repellerar varandra och gör det svårare för stabila konformationer att antas. Trots de intramolekylärt icke-stabiliserade segmenten verkar de ändå finnas en viss ordning i form av poly-l-prolin II (PPII) helix. Den är en flexibel, lösningsstabiliserad och vänstervriden helix med trefaldig rotationssymmetri där peptidkedjan domineras av ett vridmoment i vinklarna φ≈-75˚och ψ≈145˚. Huvudbeviset för att denna strukturtyp i protamin är en topp runt 1320 cm-1 i samtliga ROA-spektra, vilken tidigare assignerats till PPII struktur för flertalet andra peptider. Vidare finns en iögonfallande likhet med ROA som observerats för de nativt icke-veckade proteinerna kasein och synuklein. Under alkaliska förhållanden kan två distinkta axlar urskiljas på varsin sida av PPII-toppen, vilka indikerar att en viss formation av α-helix i detta prov. Vid jämförelse med prov lösta i hög protonkoncentration är axlarna försvinnande små vilket kan relateras till ett lägre α-helix innehåll.

Studien kompletterades med CD-mätningar (Circular Dichroism) och uppvisade typiska PPII-spektra. Projektet avslutades med ett prov där protamin jämviktats i deuterium för att studera interaktionerna hos protamin med lösningsmedlet och avslöja hydrerade grupper.

Abstract [en]

Protamines are small basic nuclear proteins that are synthesized in the late-stage spermatids. They can pack DNA into tightly bound complexes but their complete function is not yet fully known. Both the secondary and primary structures can vary among organisms. The secondary structure of salmon protamine has not yet been determined and it is of great interest to investigate the structure to understand the physiological function. Raman Optical Activity (ROA) is applied in this study to obtain new structural information, which has been impossible to obtain using other techniques. The great sensitivity to chirality at molecular vibrational levels makes ROA a powerful tool for searching structural details in solutions. A home-made Incident Circular Polarization ROA (ICP-ROA) instrument was modified in an attempt to increase the optical throughput and to obtain spectra with smaller instrumental artifacts. This involves a replacement of the input camera lens of the commercial spectrograph by a double achromatic lens with a longer input focal length of 200 mm. The alignment of the instrumental optics in the laser path was adjusted and optimized. The efficiency was increased by approximately 20 % compared to before and spectral artifacts were reduced.

ROA spectra of aqueous solutions of the protamine sulfate under different proton concentrations indicate that the protamine mainly takes an irregular structure with a low content of a-helix. This is consistent with the fact that many cationic arginyl side groups of the protamine create repelling forces which can lead a major part of the irregular structure to form the poly-l-proline II (PPII) helical structure. PPII helix is a flexible left-handed helix with a three-fold rotational symmetry with dominant peptide torsional angles of φ≈-75˚ and ψ≈145˚.

The main evidence is a strong ROA band observed at around 1320 cm-1 which has earlier been assigned to the PPII structure for several peptides and has a conspicuous similarity to PPII signals in ROA spectra of the natively unfolded proteins like caseins and synclines. The conclusion is in agreement with the CD spectra of protamine showing a characteristic PPII helical pattern. Two distinct shoulder peaks of the PPII signal in the alkaline sample indicate a stronger tendency for the a-helical structure than in the acidic sample, but the spectral differences are small. Uncharged side chains could contribute to the a-helix as a more favorable structure. Furthermore, a deuterium/hydrogen exchange was performed to reveal hydrated groups and solvent interactions of the protamine.

Place, publisher, year, edition, pages
2015. , 47 p.
Keyword [en]
Protamine, flexible protein, secondary structure, PPII, ROA
National Category
Physical Chemistry
Identifiers
URN: urn:nbn:se:kth:diva-172200OAI: oai:DiVA.org:kth-172200DiVA: diva2:846097
Available from: 2015-08-14 Created: 2015-08-14 Last updated: 2015-08-14Bibliographically approved

Open Access in DiVA

No full text

By organisation
School of Chemical Science and Engineering (CHE)
Physical Chemistry

Search outside of DiVA

GoogleGoogle Scholar

urn-nbn

Altmetric score

urn-nbn
Total: 174 hits
CiteExportLink to record
Permanent link

Direct link
Cite
Citation style
  • apa
  • harvard1
  • ieee
  • modern-language-association-8th-edition
  • vancouver
  • Other style
More styles
Language
  • de-DE
  • en-GB
  • en-US
  • fi-FI
  • nn-NO
  • nn-NB
  • sv-SE
  • Other locale
More languages
Output format
  • html
  • text
  • asciidoc
  • rtf