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Protein engineering of Subtilisin Carlsberg towards improved performance in the kinetic resolution of alcohols
KTH, School of Biotechnology (BIO).
2015 (English)Independent thesis Advanced level (degree of Master (Two Years)), 20 credits / 30 HE creditsStudent thesis
Abstract [en]

In this master thesis project, the performance of Subtilisin Carlsberg (SC) in the kinetic resolution of alcohols was explored. Methods for the heterologous expression of SC in B. subtilis WB600 were established and optimised. An EziGTM carrier material was applied receiving a combined purification and immobilisation protocol. To increase the performance of SC in the kinetic resolution of secondary alcohols via a transacylation reaction in organic solvent, protein engineering by rational design was applied. Amino acid substitutions for site-directed mutagenesis were selected by molecular modeling and literature research to improve enzyme performance in terms of both enantioselectivity (E-value, E) and general activity (product yield, y [%]). A model transacylation reaction using vinyl butyrate as acyl-donor and rac-1-phenylethanol as acyl-acceptor was used to characterize SC (E = 40 ± 10, y = 3%) and eleven SC variants. Furthermore, the model reaction was used to characterise SC and four SC variants by Michaelis-Menten kinetics using  (R)- and (S)-1-phenylethanol separately. The highest E-value was achieved when applying SC G166L/M222F double variant in the model reaction (E = 165±17). Also this double variant showed a good performance in the kinetic resolution using rac-1-phenylethanol (E = 122±26, y = 20%). Another double variant of SC, G166L/M222C, performed equally well in the kinetic resolution of the model reaction (E = 125 ± 10, y = 16%). In addition, the SC G166L/M222C variant was shown to convert a larger substrate rac-1-phenylpropanol with excellent enatnioselectivity (E = 335 ± 33, y = 6%) compared to wild type SC (E = 23, y = 0,3%). To summarize, two variants of SC (G166L/M222C and G166L/M222F) were created and showed improved performance when applied in the kinetic resolution of rac-1-phenylethanol, compared to the wild-type enzyme.

Abstract [de]

In dieser Masterarbeit wurde di Leistungsfähigkeit von Subtilisin Carlsberg (SC) in der kinetische Rzematspaltung von Alkoholen untersucht. Methoden für die heterologe Expression von SC in B- subtilis WB600 wurden etabliert und uptimiert. Ein EziGTM Trägermaterial wurde zur simultanen Reinigung und Immobilisierung verwendet. Gestützt auf Literaturangaben und Molekularer Modellierung wurden elf Mutanten von SC erstellt, diegesteigerte Enantioselektivit't (E-Wert, E) una allgemeine Aktivität (Produktausbeute, y [%]) zeigen sollten. Eine Modellreaktion basierend auf der Tramsacylierung von 1-Phenylethanol (Acyl-Akzeptor) mit Vinylbutyrat (Acyl-Donor) in organischem Lösungsmittel wurde verwendet, um die Leistungsfähigkeit von SC zu untersuchen (SC: E = 40±10, y = 3%). Des Weiteren wurde die Modellreaktion zur Charakterisierung von SC und vier Mutanten mittels Michealis-Menten Kinetik verwendet, wobei (R)- und (S)-1-Phenylethanol separat betrachtet wurden. Der höchste E-Wer wirde dabei mit der G166L/M222F Doppelmutante erreicht (E = 165 ± 17). Diese Doppelmutante lieferte im Vergleich zum Wildtyp ebenfalls gute Ergebnisse in der kinetischen Razematspaltung von rax-1-Phenylethanol (E = 122±26, y = 20%). Eine andere Doppelmutante, G166L/M222C, lieferte vergleichbare Ergebnisse in der Modellreaktion (E = 125±10, y = 16%) und wurde erfolgreich in der kinetishcen Razematspaltung des grösseren Alkohols, 1-Phenylpropanol, eingesetzt (E = 335±33, y = 6%).Im Vergleich dazu wurde beim Wildtyp ein deutlish niedriger E-Wert bei geringer Produktausbeute bestimmt (E=23, y = 0,3%). Zusammenfassend wurden zwei Varianten von SC erstellt, welche im Vergleich zum Wildtyp eine gesteigerte Leistungsfähigkeit in der kinetischen Razematspaltung von rac-1-Phenylethanol lieferten.

Place, publisher, year, edition, pages
2015.
Keyword [en]
protein engineering, Subtilisin Carlsberg, sec-alcohols, transacylation, biocatalysis
National Category
Engineering and Technology
Identifiers
URN: urn:nbn:se:kth:diva-179148OAI: oai:DiVA.org:kth-179148DiVA: diva2:881652
Educational program
Master of Science in Engineering - Biotechnology
Supervisors
Examiners
Available from: 2015-12-15 Created: 2015-12-11 Last updated: 2015-12-15Bibliographically approved

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Engineering and Technology

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