Autoimmune disease diagnosis and definition of prognosis can be challenging. Patients with the same autoimmune disease could present with very heterogeneous symptoms. Therefore, there is a need to understand the disease better to improve patients’ diagnosis, and classification, and tailor the treatment. Autoantibodies are a hallmark of many autoimmune diseases. They are antibodies produced by B cells and targeting self-antigens. Autoantibodies could be useful as diagnostic and prognostic markers of autoimmune disease.

Protein arrays enable multiplex and high-throughput profiling of autoantibodies, therefore representing a good tool for autoantibody markers discovery and validation. This thesis presents the work performed to study autoantibodies in ANCA Associated Vasculitis (AAV) and Systemic Sclerosis (SSc) by employing planar and bead-based antigen arrays. Moreover, this thesis also includes the work done to optimize the application of a multiplex serology assay for the detection of anti-SARS-CoV-2 antibodies in saliva.

In paper 1, we aimed to perform a broad autoantibody profiling in serum samples of AAV patients to search for new autoantibodies associated with the disease or disease subgroups and activity. The main result is related to the identification of anti-KIF5C antibodies at high prevalence in anti-MPO-positive patients and patients with microscopic polyangiitis (MPA). Anti-KIF4A also showed a higher prevalence in anti-MPO positive and MPA patients.

In Paper 2 an in-depth autoantibody profiling was performed to identify autoantibodies as candidates for future relapse prediction in the plasma of AAV patients. We tested samples from patients classified as long-term remission-off-therapy (LTROT) and patients suffering future flares. Nine autoantibodies were found with higher reactivity in the relapse group. Among these, anti-ATF3 antibodies had increased reactivity in patients with kidney and ENT symptoms.

In paper 3, plasma samples from SSc patients and controls were tested to detect autoantibodies associated with fibrosis. We identified eleven autoantibodies with increased prevalence in patients with systemic sclerosis compared to the control group. Eight of these autoantibodies are new in the context of systemic sclerosis and all bind to proteins that are involved in fibrosis. Among these, the anti-AKT3 was shown to be more reactive in patients with skin and lung fibrosis and anti-PIP4K2B in patients that were negative for the available diagnostic marker.

Finally, in paper 4, a multiplex bead-based array serological assay was optimized to detect anti-SARS-CoV-2–specific IgG and IgA in saliva samples. This method was developed to measure antibodies, using SARS-CoV-2 spike and nucleocapsid proteins.

In conclusion, the described work shows the application of the protein array technology to identify (auto)antibodies in different body fluids and within autoimmune diseases and SARS-CoV-2 infection. Moreover, we have identified autoantibody targets that are worth further investigation for their usefulness in better understanding some autoimmune conditions.

Autoimmuna sjukdomar diagnos och definition av prognos kan vara utmanande. Patienter med samma autoimmuna sjukdom kan uppvisa mycket heterogena symtom. Därför finns det ett behov av att förstå sjukdomen bättre för att förbättra patienternas diagnostik, bättre klassificering av patienter och skräddarsydd behandling. Autoantikroppar är ett kännetecken för många autoimmuna sjukdomar. De är antikroppar som produceras av B-celler och riktar sig mot självantigener. Autoantikroppar kan vara användbara som diagnostiska och prognostiska markörer för autoimmun sjukdom.

Proteinmatriser möjliggör multiplex och högkapacitetsprofilering av autoantikroppar, och representerar därför ett bra verktyg för upptäckt och validering av autoantikroppsmarkörer. I den presenterade avhandlingen utfördes arbetet med att studera autoantikroppar i ANCA Associated Vasculitis (AAV) och Systemic Sclerosis (SSc) genom att använda plana och kulbaserade antigenarrayer. Dessutom inkluderar denna avhandling också det arbete som gjorts för att optimera tillämpningen av en multiplex serologisk analys för detektion av anti-SARS-CoV-2 antikroppar i saliv.

I artikel 1 syftade vi till att utföra en bred autoantikroppsprofilering i serumprover av AAV-patienter för att söka efter nya autoantikroppar associerade med sjukdomen eller sjukdomens undergrupper och aktivitet. Huvudresultatet är relaterat till identifiering av anti-KIF5C-antikroppar med hög prevalens hos anti-MPO-positiva patienter och hos patienter med mikroskopisk polyangit (MPA). Anti-KIF4A visade också en högre prevalens hos anti-MPO-positiva och MPA-patienter.

I artikel 2 utfördes en djupgående profilering av autoantikroppar för att identifiera autoantikroppar som kandidater för framtida återfallsförutsägelse i plasma från AAV-patienter. Vi testade prover från patienter som klassificerats som långvarig remission-off-terapi (LTROT) och patienter som lider av framtida flare. Nio autoantikroppar hittades med högre reaktivitet i återfallsgruppen. Bland dessa hade anti-ATF3-antikroppar ökad reaktivitet hos patienter med njure och ÖNH-symtom.

I artikel 3 testades plasmaprover från SSc-patienter och kontroller för att detektera autoantikroppar associerade med fibros. Vi identifierade elva autoantikroppar med ökad prevalens hos patienter med systemisk skleros jämfört med kontrollgruppen. Åtta av dessa autoantikroppar är nya i samband med systemisk skleros och alla binder till proteiner som är involverade i fibros. Bland dessa visade sig anti-AKT3 vara mer reaktiv hos patienter med hud- och lungfibros och anti-PIP4K2B hos patienter som var negativa för den tillgängliga diagnostiska markören.

Slutligen i papper 4 optimerades multiplex pärlor-baserad array-teknologi för att detektera anti-SARS-CoV-2-specifika IgG och IgA i salivprover. Denna metod utvecklades för att mäta antikroppar, med hjälp av SARS-CoV-2-spik och nukleokapsidproteiner.

Sammanfattningsvis visar det beskrivna arbetet tillämpningen av protein array-teknologin för att identifiera (auto)antikroppar i olika kroppsvätskor och i synnerhet inom autoimmunitet, men även SARS-CoV-2-infektion. Dessutom har vi identifierat autoantikroppsmål som är värda ytterligare undersökning för deras användbarhet för att bättre förstå vissa autoimmuna tillstånd.

Proteins are the primary workhorses of the cell, carrying out virtually all processes to sustain cellular functioning. From enzymes that catalyze biochemical reactions, to motor proteins that transport large cellular cargo across the cell, protein functions are as diverse as the unique amino acid sequences that compose the proteins. Protein function is largely dependent on the subcellular localization of the protein, as subcellular compartmentalization enables different environments that are suitable for different reactions. Knowledge about protein localization and function can, in the broader context, help us understand the cell in health and disease, as protein dysfunction and mislocalization are key drivers of developing disease.

 The work in this thesis has been carried out within the framework of the Human Protein Atlas (HPA) initiative, primarily for the subcellular resource. In Paper I, we measured the autoantibody profiles of patients with systemic sclerosis with the goal to identify new candidate biomarkers associated with fibrosis. We performed a near proteome-wide, untargeted screen combined with a targeted bead array and revealed 11 autoantibodies with higher prevalence in patients with systemic sclerosis than in controls. Two of these show high potential for being used as biomarkers for systemic sclerosis patients that are affected by skin and lung fibrosis. 

 For Paper II, we took advantage of the vast image library generated by the subcellular resource of HPA to create an image-based map of the micronuclear proteome. In total, we identified 944 proteins as micronuclear, dominated by proteins associated with nuclear and chromatin processes. The findings of this study expand our view of micronuclei as byproducts of mitotic errors to potential active participants in biological processes. In Paper III, we applied antibody-based spatial proteomics combined with 3D confocal imaging to map 715 proteins to primary cilia, and three ciliary substructures, across three different cell lines. Of the identified proteins, 91 had not been identified in cilia before, expanding our knowledge on the ciliary proteome and function. The findings of the study portray cilia as sensors able to tune their proteome to effectively sense the environment to compute cellular responses. Finally, in Paper IV, we mapped the subcellular localization of a subset of the human sperm proteome to 11 distinct subcellular structures of human sperm cells, providing the first image-based resource on protein localization in sperm cells. We found that 54% of the studied sperm proteins vary in spatial distribution and/or abundance between individual sperm, which raises the question of subpopulations of sperm. 

 In summary, this thesis expands our knowledge on protein localization in specialized subcellular structures and provides a foundation for further in-depth research into the mechanisms behind the drivers of certain diseases, such as for autoimmunity, cancers, ciliopathies, and male infertility phenotypes. 

Proteiner utgör det huvudsakliga maskineriet i cellen. Deras funktioner är lika varierande som de unika aminosyrasekvenser som utgör proteinerna. Från enzymer som katalyserar biokemiska reaktioner, till motorproteiner som transporterar cellulärt gods, de ansvarar för praktiskt taget alla processer som krävs för att cellen ska vara funktionsduglig. Proteiners funktion utgörs till stor del av deras subcellulära lokalisering. Detta eftersom den subcellulära uppdelningen av olika utrymmen möjliggör varierande miljöer lämpade för olika biokemiska reaktioner. I en bredare kontext kan kunskap om proteiners lokalisering och funktion ge oss en bättre bild av hur cellen fungerar, både vid hälsa och sjukdom då funktionsrubbningar och fellokaliseringar av proteiner är drivande faktorer i flertalet sjukdomsförlopp. 

 Denna avhandling har genomförts inom ramen av Human Protein Atlas (HPA), främst inom den subcellulära resursen. I Artikel I, undersökte vi autoantikroppsprofiler i patienter med systemisk skleros med syftet att identifiera nya kandidater till biomarkörer kopplade till fibros. Vi använde oss av två olika analysmetoder: en baserad på 42 000 antigen från HPA fixerade på en plan yta för en icke-riktad analys, följt av antigen fixerade på magnetiska mikrosfärer för en riktad analys. Vi identifierade 11 autoantikroppar som hade högre prevalens bland patienter med systemisk skleros jämfört med kontroller. Två av dessa visade hög potential att användas som biomarkörer för patienter med systemisk skleros som är påverkade av bindvävsförtjockning i huden samt lungfibros. 

 I Artikel II, utnyttjade vi det enorma bildbiblioteket genererat av den subcellulära resursen av HPA för att kartlägga proteomet i mikrokärnor. Vi identifierade totalt 944 proteiner i mikrokärnor. Dessa proteiner domineras av proteiner som är involverade i processer relaterade till kärnan samt kromatin. Resultaten av denna studie expanderar vår bild av mikrokärnor från en biprodukt av bristfälligheter vid celldelning, till potentiella aktiva aktörer i cellulära processer.   

I Artikel III, tillämpade vi antikroppsbaserad spatiell proteomik kombinerat med konfokalmikroskopi i 3D för att kartlägga proteiner i primära cilier samt tre relaterade substrukturer. Vi identifierade totalt 715 proteiner. Av dessa hade 91 proteiner inte identifierats i cilier i någon art, vilket utvidgar vår kunskap om primära cilier, dess proteom samt funktion. Resultaten av denna studie framställer primära cilier som sensorer som kan finjustera sitt proteom för att effektivt känna av sin omgivning för att beräkna en cellulär respons. 

Slutligen, i Artikel IV, kartlade vi en andel av proteomet i mänskliga spermier till 11 olika substrukturer. Detta är den första bildbaserade kartläggningen av proteinlokalisering i spermier. Av de 652 identifierade proteinerna visade 54% variation i lokalisering eller uttryck mellan individuella spermier från en donator, vilket väcker frågan om delpopulationer av spermier.

Sammanfattningsvis, denna avhandling utvidgar vår kunskap om proteinlokalisering i specialiserade subcellulära strukturer och tillhandahåller en resurs för fortsatta studier på sjukdomsmekanismer för sjukdomar som autoimmunitet, cancer, ciliopatier samt manlig infertilitet.