Saprolegnia parasitica är en patogen oomycet (algsvamp) som orsakar allvarliga infektioner hos sötvattensfiskar och därmed stora ekonomiska förluster inom vattenbruket. Den utsöndrar olika effektorproteiner för att infektera fisken, bland annat potentiella kitinaser som kan bryta ner kitinrika delar av fiskens vävnad. Ett sådant protein, SPRG_09551, valdes ut som kandidat för karakterisering på grund av dess möjliga roll i sjukdomsprocessen. Att uttrycka detta protein i Escherichia coli har dock varit svårt eftersom det bildar olösliga inklusionskroppar.

Syftet med detta examensarbete var att förbättra lösligheten hos SPRG_09551 genom att samuttrycka det med molekylära chaperoner i E. coli. Fem olika chaperonsystem — pG-KJE8, pGro7, pKJE7, pG-Tf2 och pTf16 — testades i två olika E. coli-stammar (BL21 och TOP10). Transformationsmetoder, uttrycks¬förhållanden och induktionsprotokoll optimerades i småskaliga försök. Lösligheten hos proteinet undersöktes med SDS-PAGE och Western blot för att jämföra mängden lösligt och olösligt protein.

Det visade sig att samuttryck vid 16 °C efter induktion av målproteinet ökade lösligheten. Chaperonsystemet pGro7 (GroEL-GroES) i E. coli BL21 gav bäst lösligt uttryck av SPRG_09551. Genom att skala upp detta system kunde proteinet renas med affinitetskromatografi under förhållanden som bevarar proteinets naturliga form. Dock kvarstår utmaningen att chaperonproteiner, särskilt GroEL, följer med vid reningen, vilket komplicerar framtida strukturella och funktionella studier. Därför behövs ytterligare optimering av reningsprocessen för att få fram höggradigt rent SPRG_09551 som lämpar sig för mer detaljerad karakterisering i syfte att vidareutveckla riktade anti-oomycetbehandlingar och stärka motståndskraften inom vattenbruket.

Saprolegnia parasitica is a pathogenic oomycete responsible for severe infections in freshwater fish, causing substantial economic losses in aquaculture. The organism secretes various effector proteins to facilitate host invasion, including putative chitinases that may degrade chitin-rich fish tissues. One such protein, SPRG_09551, was selected for characterization as a candidate effector due to its potential role in virulence. However, heterologous expression of this protein in Escherichia coli has been hindered by poor solubility and inclusion body formation.

This thesis aimed to optimize the soluble expression of SPRG_09551 through co-expression with molecular chaperones in E. coli. Five different chaperone systems—pG-KJE8, pGro7, pKJE7, pG-Tf2, and pTf16—were tested in two E. coli strains (BL21 and TOP10). Transformation efficiency, expression conditions, and induction strategies were optimized in small-scale screens. Solubility of the expressed protein was evaluated by SDS-PAGE analysis and Western blot of soluble and insoluble fractions.

It was found that co-expression at 16°C after target protein induction increased the solubility. The chaperone system pGro7 (GroEL-GroES) co-expressed in E. coli BL21 led to the highest soluble yield of SPRG_09551. Scale-up of this system enabled purification of the target protein via affinity chromatography under native conditions. However, co-purification of chaperone proteins, particularly GroEL, presents a challenge for downstream structural and functional studies. Further optimization of purification strategies will be necessary to obtain highly pure SPRG_09551 suitable for detailed characterization for further developing targeted anti-oomycete therapies and improving aquaculture resilience.