Sepsis is a life-threatening condition affecting an estimated 49 million people annually and causing approximately 20% of the deaths worldwide. Survival in septic shock decreases by about 8% per hour of delayed or inappropriate treatment, making rapid diagnosis critical. Consequently, patient outcomes strongly depend on the rapid initiation of appropriate antimicrobial therapy, making sepsis diagnosis a fight against time. However, current blood culture-based workflows typically require several days to deliver actionable results, largely due to the extremely low bacterial concentrations in blood (1-100 CFU/mL) that necessitate time-consuming culture steps. There is therefore a pressing need for diagnostic protocols capable of rapidly isolating and characterizing bacteria directly from blood.

In this work, we address a key limitation in current diagnostic pipelines by developing and evaluating culture-free approaches for the rapid isolation, detection, species identification, and antimicrobial susceptibility testing (AST) of bacteria directly from blood, starting at clinically relevant concentrations. Two centrifugation-based sample preparation strategies were developed: one compatible with samples drawn into blood culture bottles and one designed for whole blood. Using the first approach, we demonstrated the isolation and identification of five common sepsis-causing bacteria within 12 hours. This approach relies solely on standard laboratory equipment, which facilitates direct translation to clinical laboratories. The whole-blood approach combines centrifugation and selective blood cell lysis with microfluidic trapping and deep learning-based automated detection, and enables culture-free detection of bacteria from blood within 2 h. Building on this foundation, the workflow was further extended to integrate real-time automated detection, single-cell phenotypic AST, and species identification by fluorescence in situ hybridization (FISH), directly from uncultured blood in under 7 h. 

The sample preparation steps of these protocols rely heavily on manual processing. Therefore, subsequent work focused on the development of a one-step centrifuge device that automates bacterial isolation and up-concentration while maintaining compatibility with downstream processes, such as subculturing, mass spectrometry-based identification, and microfluidic single-cell analysis. All approaches were evaluated using healthy human blood samples spiked with common sepsis-causing bacteria, and serve as proof-of-concept of rapid, culture-free bacterial characterization directly from blood.

Together, the results presented in this thesis demonstrate the potential of combining centrifugation-based sample preparation, microfluidics, and automated image analysis to substantially shorten diagnostic turnaround times for sepsis and bloodstream infections. Although further validation with clinical samples and increased automation are required, this work provides experimental and methodological advances toward faster sepsis diagnostics.

Sepsis är ett livshotande tillstånd som drabbar uppskattningsvis 49 miljoner människor årligen och står för ungefär 20% av alla dödsfall världen över. Överlevnad i septisk chock minskar med cirka 8% för varje timme som behandling fördröjs eller hanteras fel, varför en snabb diagnos är kritisk. Patientens utfall är därför strängt beroende av en snabb initiering av en korrekt behandling, vilket gör sepsisdiagnostik till en kamp mot klockan. Nuvarande arbetsflöden med blododling kräver dock vanligtvis flera dagar innan man får resultat som går att agera på, till stor del beror detta på extremt låga koncentrationer av bakterier i blodprover (1-100 CFU/ml) som kräver tidsödande odlingssteg. Det finns därför ett tryckande behov av diagnostiska protokoll som klarar att snabbt isolera och identifiera bakterier direkt från blod.

I det här arbetet addresserar vi centrala begränsningar i nuvarande diagnostiska flöden genom att utveckla och utvärdera odlingsfria metoder för snabb isolering, detektion och artidentifiering, samt antimikrobiell susceptibilitetstestning (AST) av bakterier direkt från blod, testad vid kliniskt relevanta koncentrationer. Två centrifug-baserade metoder för blodprovsberedning utvecklades: den ena kompatibel med prover som är tagna i blododlingsflaskor och den andra utvecklad för helblod. Genom den första metoden demonstrerar vi isolering och identifiering av fem vanliga bakterier som orsakar sepsis inom 12 timmar. Denna metod utnyttjar enbart standardiserad labbutrustning vilket möjliggör direkt translation hos kliniska laboratorier. Metoden för helblod kombinerar centrifugering och selektiv lysering av blod med mikrofluidiska fällor och deep learning baserad automatisk detektion, och möjliggör odlingsfri detektion av bakterier i blod inom 2 timmar. Med detta som bas vidareutvecklades arbetsflödet till att också inkludera automatisk realtidsdetektion, singel-cell fenotyp AST och artidentifiering genom fluorescens in situ hybridisering (FISH), direkt från blod på under 7 timmar. 

Provberedningsstegen i dessa protokoll är väldigt beroende av manuella processer. Således fokuserade efterföljande arbete på utvecklingen av en device för enstegs-centrifugering som automatiserar isolering av bakterier och uppkoncentrering och som samtidigt bibehåller kompatibilitet med processer nedströms, såsom subodlingar, mass-spektrometri-baserad identifikation, samt mikrofluidisk singelcells-analys. Alla metoder utvärderades med hjälp av friska humana blodprover som spikats med vanliga sepsisorsakande bakterier och tjänar som ett proof-of-concept för snabb, odlingsfri bakteriell karakterisering direkt från blod. 

Tillsammans demonstrerar resultaten i denna avhandling potentialen i att kombinera centrifugeringsbaserad provberedning, mikrofluidik och automatiserad bildanalys för att avsevärt förkorta diagnostiska svarstider för sepsis och infektioner i blodbanan. Även om vidare arbete med validering med kliniska prover och ökad automatisering krävs, bidrar detta arbete med experimentella och metodologiska framsteg mot snabbare sepsisdiagnostik.