Optical imaging of biological samples is limited by light scattering andabsorption, which reduce penetration depth and image quality. Tissueclearing protocols have been developed to address these issues by removingpigments and reducing refractive index mismatches. This makes it possibleto image larger samples in three dimensions without the need for physicalsectioning.This project evaluated how well existing clearing protocols (2ECi, PEGASOS,iDISCO+) perform on strongly pigmented rat embryos and adult zebrafish,and tested custom protocol variants combining bleaching, pretreatments, andstaining. Performance was evaluated by visual inspection, light sheet andconfocal microscopy, and quantitative analysis (FRC-QE and z-intensityprofiles).The results showed that existing protocols were not fully effective in ratembryos, with strong pigmentation remaining in blood-rich tissues such asliver. Fast Green provided clear structural contrast in light sheet images.Bleaching was the most effective step for improving transparency, especiallyin liver, and also enhanced staining. However, it introduced air bubblesthat strongly reduced image quality. Shorter methanol-based bleaching atlow temperature reduced bubble formation compared to longer PBS-basedbleaching. Vacuum treatment partly restored image quality by reducingair bubbles. These observations were supported by quantitative analysis,although differences in imaging conditions made the results difficult tocompare directly. In zebrafish, bleaching improved transparency, whereasEDTA decalcification had little effect in the tested regions and CUBIC-Lalone was not sufficient to remove pigments.Overall, bleaching emerged as the most critical factor for pigment removal inboth rat embryos and zebrafish, but the conditions still require optimizationto balance transparency with tissue preservation.

Optisk avbildning av biologiska prover begränsas av ljusspridning ochabsorption, vilket minskar både penetrationsdjup och bildkvalitet. Tissueclearing-protokoll har utvecklats för att reducera pigment och skillnader ibrytningsindex, vilket gör det möjligt att avbilda större prover i tre dimensionerutan fysisk snittning.Detta projekt undersökte hur väl etablerade protokoll (2ECi, PEGASOS,iDISCO+) presterar på starkt pigmenterade råttembryon och vuxnazebrafiskar, samt prövade egna protokollvarianter som kombinerade blekning,förbehandlingar och färgning med Fast Green. Utvärderingen gjordes visuellt,med light sheet- och konfokalmikroskopi samt kvantitativ analys (FRC-QEoch z-intensitetsprofiler).Resultaten visade att de befintliga protokollen inte var fullt effektiva påråttembryon, där kraftig pigmentering kvarstod i blodrika vävnader somlevern. Fast Green gav tydlig kontrast i light sheet-avbildning. Blekning vardet mest effektiva steget för att förbättra transparens, särskilt i lever, ochförstärkte även färgningen med Fast Green. Dock gav blekning upphov tillluftbubblor som kraftigt försämrade bildkvaliteten. Kortare metanolbaseradblekning vid låg temperatur minskade antalet bubblor jämfört med längre PBS-baserad blekning. Vakuumbehandling kunde delvis förbättra bildkvalitetengenom att reducera bubblorna. Dessa observationer bekräftades av kvantitativanalys, även om skillnader i avbildningsförhållanden gjorde resultaten svåraatt jämföra direkt. I zebrafiskprover förbättrade blekning transparensen.EDTA-avkalkning hade däremot liten effekt i de testade områdena, ochCUBIC-L var inte en tillräcklig förbehandling för att ta bort pigment.Sammanfattningsvis framstod blekning som den mest avgörande faktorn förpigmentborttagning i både råttembryon och zebrafiskar, men förhållandenabehöver fortfarande optimeras för att balansera transparens med bevarandetav vävnadsstruktur.