Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory autoimmune disease that mainly affects joints, causing discomfort and pain that severely reduces the life quality of affected individuals. Its etiology is largely unknown, but some pathophysiological mechanisms have been identified. These include formation of anti-citrullinated protein antibodies (ACPAs) and rheumatic factors (RFs), local proliferation of mesenchymal cells, and recruitment of T- and B cells to the affected synovium. Lymphocyte infiltration results in elevated levels of cytokines such as Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-α) and interleukin signaling, which in turn triggers protease activation that gradually degrades the synovium and underlying bone. 

In many cases RA can be effectively managed by early diagnosis followed by treatment with disease-modifying anti-rheumatic drugs (DMARDs). However, this is not true for all patients and there is currently no cure for RA. Synovial lesions in RA patients exhibit complex histopathological manifestations involving the formation of lymphoid follicles with highly organized Ectopic Lymphoid Structures (ELS). These have been extensively studied using immunostaining and other cytological methods, either by targeting a few specific molecular markers in tissue sections or by examining homogenized suspensions of complex samples, which causes a loss of local and spatial tissue information. 

This thesis reports the use of Spatial Transcriptomics (ST) to study gene expression in tissue samples from RA patients while preserving spatial information. The method was applied to RA biopsies from early onset and untreated RA to late-stage established disease with edema, providing comprehensive coverage of the spatio-temporal dynamics of the inflamed joints. 

Paper I introduces sRIN, a novel method of assessing the quality of RNA in tissue sections that is similar to RNA Integrity Number (RIN) analysis for bulk RNA but with single-cell resolution. The aim was to find ways of analyzing clinically rare samples for further processing with ST. Paper II uses ST to study tissue samples from RA joints with long-standing disease, using Spondyloarthritis (SpA) as a disease control. The resulting comprehensive transcriptomic data were used to perform in silico immune cell prediction and revealed how immune cell infiltration in RA differs from that in SpA in more detail than was previously possible using traditional pathological methods. As a follow up, Paper III investigates inflamed RA joints in even greater detail by using several adjacent tissue sections to build a three-dimensional atlas of assumed ELS areas. Finally, Paper IV uses four distinct technologies to study untreated early onset RA patients. Spatial tissue analysis with ST was combined with single cell RNA sequencing (scRNA-Seq) of fluorescence-activated cell sorted (FACS) B cells. These two methods were complemented with immunohistochemistry (IHC) for validation and sRIN to assess the quality of the clinical samples. B cells are known to play a key role in RA by producing self-reactive antibodies. This work showed that B cell maturation and ELS formation are detectable even in early onset RA, and revealed mechanisms supporting survival niches in hyperplastic joints. Overall, these studies shed new light on the complex nature of Rheumatoid arthritis, characterize the site of infection with greater granularity than was previously possible, and reveal novel disease patterns with clinical implications that warrant further study.

Reumatoid artrit (RA) är en kronisk inflammatorisk autoimmun sjukdom som främst drabbar leder och orsakar obehag såsom smärta, varpå livskvaliteten hos den drabbade individen avsevärt försämras. Etiologin bakom RA är mestadels okänd trots att några patofysiologiska mekanismer såsom bildandet av anti-citrullinated protein antibodies (ACPAs), Rheumatic factors (RFs), lokal prolifiering av mesenchymala celler och rekrytering av T- och B-celler till de drabbade lederna har identifierats. Lymphocytinfiltration resulterar i kronisk sjukdom med förhöjda nivåer av cytokiner (såsom Tumor necrosis factor alpha; TNF-α) och interleukinsignalering vilket triggar proteasaktivering som gradvis bryter ned synovium och det underliggande skelettet. I många fall kan RA effektivt behandlas med hjälp av de nyare disease-modifying anti-rheumatic drugs (DMARDs) och tidigare diagnos av patienten. Detta fungerar dock inte för alla patienter och en bot for RA existerar ännu inte. 

Synoviala skador i RA visar på komplexa histopatologiska manifestationer vilka inkluderar bildandet av lymfoida folliklar men även Ectopic Lymphoid Structures (ELS) vilka har blivit noggrant studerade med immuninfärgning och andra cytologiska metoder. Dessa metoder saknar antingen omfattande detektion av målmolekyler eller saknar information om den spatiala kontexten av dessa målmolekyler. 

I denna avhandling har vi tillämpat Spatial Transcriptomics (ST), en metod som tillåter genexpressionstudier med bevarad spatial information. Denna metod används på RA biopsier från tidigt obehandlad RA till långtgående etablerad sjukdom med ödem. Med andra ord täcker avhandlingen hela den spatio-temporala dynamiken i inflammerade leder. Arikel I beskriver en ny metod för att bestämma kvaliteten av RNA likt RNA Integrity Number (RIN) i bulk, men med singelcellupplösning på vävnadssnitt. Målet är att studera kliniskt sällsynta prover för vidare bearbetning med ST. Artikel II undersöker långtgående inflammerade RA-leder med Spondyloartrit (SpA) som sjukdomskontroll med hjälp av ST. Här utförde vi immuncellprediktion in silico från det omfattande transkriptomdata vi tillhandahöll och kunde se skillnaderna i infiltrat i RA jämfört med SpA med större detaljrikedom än vad traditionell patologi tidigare gjort. Som en uppföljning undersöker Artikel III RA-vävnader med ännu större detaljrikedom genom användandet av exakt intilliggande vävnadssnitt från RA-patienter för att bygga en tredimensionell atlas över presumtiva ELS i inflammerade vävnader. Slutligen använder Artikel IV fyra olika teknologier för att studera tidig obehandlad RA. Vi använde ST för vävnadsanalys i kombination med singelcell RNA-sekvensering (scRNA-Seq) från Fluorescence-activated cell sorted (FACS) B-celler. Dessa två metoder kompletterades med immunohistochemistry (IHC) för validering och sRIN så vi kunde bestämma kvaliteten på de kliniska proverna. Här fann vi bevis för B-cellsmognad och ELS-bildande redan i tidig RA och mekanismer som kan vara kopplade till så kallad ”survival niche”. Dessa studier syftar till att täcka det komplexa RA och karaktärisera sjukdomen med högre upplösning än tidigare och även föreslå nya sjukdomsmönster som kan komma att bli värdefulla i studier med klinisk innebörd.  

In the present moment of time, we find ourselves in a period where the advancement of genomic tools is progressing at a fast pace. Of particular interest for this thesis is the study of gene activity. What patterns of genes are expressed? Where are they expressed? How can we use this knowledge to improve our quality of life? The research presented in this thesis focuses on developing and applying new tools for interrogating cells and tissues. In Paper I, we describe a protocol for transcript profiling of single cells, capable of measuring the relative expression levels for genes of interest. We successfully applied our method to cancer cells from metastatic breast cancer patients. Profiling 2 to 4 single cells per patient and measuring gene-specific expression from targets previously associated with metastatic breast cancer supports the use of our protocol as a diagnostic tool. In Paper II, we present an assay for spatial RNA quality evaluation, used to estimate the success for tissue specimens before proceeding with more expensive spatial sequencing methods. We showed that the method is capable of measuring high RNA quality in tissue areas of both high and low cell density and that the spatial RNA integrity patterns are reflected in spatial transcriptomics data. In Paper III, we present a protocol for performing spatial mRNA genome-wide expression profiling of FFPE tissue specimens. Thus, we bridge a gap between traditional tissue preservation methods and novel gene technologytools. We found a high Pearson correlation of 0.95 between formalin-fixation paraffin embedding (FFPE) and Fresh Frozen (FF) mouse brain datasets. Although the FPPE samples yielded fewer transcripts and genes compared to FF, there was a high agreement in gene expression between paired anatomical areas for FFPE and FF samples. In Paper IV, we present an approach to investigate in situ transcript derivedinferred copy number variation (iCNV) profiles based on spatial transcriptomics data. In a normal lymph node that displays both distinct gene expression patterns and histological landmarks, we observed a neutral iCNV profile. In contrast, we found huge variabilities investigating several malign tissue types ranging from homogenous (pediatric medulloblastoma) to highly variable genomes (ductal breast cancer and glioblastoma). Strikingly, we also observed similar iCNV profiles in both tumor and benign tissue areas from prostate and skin cancer. In Paper V, we explore the transcriptional and genomic landscape in pediatric tumors from 14 patients. Microglia cells have been implicated to play an important role in the tumor microenvironment, and we found spatial co-localization of microglia and epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) signatures in our patient cohort. Furthermore, we found homogenous and recurrent iCNV profiles in the high-grade tumors of relapse patients and identified expression of gene SPP1 in the tumor stroma as a potential prognostic mRNA marker in pediatric brain tumor relapse patients.

Vi befinner oss i en tid där framsteg för genomiska verktyg fortskrider i snabb takt. Av särskilt intresse för denna avhandling är studier av genaktivitet. Vilka genmönster uttrycks? Var uttrycks de? Hur kan vi använda denna kunskap för att förbättra vår livskvalitet? Forskningen som presenteras i denna avhandling fokuserar på att utveckla och tillämpa nya verktyg för att inhämta information från celler och vävnader. I Artikel I beskriver vi ett protokoll för profilering av transkript i enstaka celler som kan mäta de relativa uttrycksnivåerna för gener av intresse. Vi har framgångsrikt tillämpat vår metod på cancerceller från metastatiska bröstcancerpatienter. Profilering utfördes på 2 till 4 celler per patient och uppmätte ett genspecifikt uttryck från markörer som tidigare varit associerade med metastatisk bröstcancer. Dessa resultat stöder användningen av vårt protokoll som ett diagnostiskt verktyg. I Artikel II presenterar vi en analys för utvärdering av spatial RNA-kvalitet, som används för att estimera integriteten av vävnadsprover innan dyrare spatiala sekvenseringsmetoder appliceras. Vi visade att metoden kan uppmäta hög RNA-kvalitet i vävnadsområden med både hög och låg celltäthet, samt att de spatiala RNA-integritetsmönstren återspeglas i spatial transkriptomikdata. I Artikel III presenterar vi ett protokoll för att utföra spatial mRNA genom profilering av FFPE-vävnadsprover. Således sammanlänkar vi traditionella vävnadsbevaringsmetoder med nya gentekniska verktyg. Vi observerade en hög Pearson-korrelation på 0.95 mellan formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) och färskfrysta (FF) datasett från mushjärna. Även om ett mindre antal transkript och gener kunde utvinnas från FFPE jämfört med FF prover, fanns det en hög överensstämmelse i genuttryck mellan parade anatomiska områden för FFPE- och FF-prover. I Artikel IV presenterar vi ett tillvägagångssätt för att undersöka variationer i inferrerade spatiala genkopior (iCNV) inom vävnadssnitt, baserat på spatial transkriptomikdata. I normal lymfkörtel som visar både distinkta genuttrycksmönster och histologiska landmärken observerade vi en neutral iCNV - profil. Däremot fann vi stora variationer från homogena (pediatriska medulloblastom) till mycket variabla genom (duktal bröstcancer och glioblastom) när vi undersökte flera maligna vävnadstyper. Påfallande nog observerade vi också liknande iCNV -profiler i både tumör- och godartade vävnadsområden från prostata och hudcancer. I Artikel V utforskar vi det transkriptionella och genomiska landskapet i pediatriska tumörer från 14 patienter. Microglia-celler har implicerats att spela en viktig roll i tumörmikromiljön, och vi fann spatial samlokalisering av mikroglia och epitel-till-mesenkymal övergångs (EMT) signaturer i vår patientgrupp. Vidare hittade vi homogena och återkommande iCNV-profiler i höggradiga tumörer hos återfallspatienter och identifierade genuttryck av SPP1 inom tumörstroman som en potentiell prognostisk mRNA-markör hos pediatriska patienter med återfall av hjärntumör.

Spatial transcriptomics (ST) revolutionized the study of gene expression within tissue sections, yet its application to clinically relevant material has remained limited by technical constraints related to sample characteristics and RNA quality. This thesis advances the use of spatial transcriptomics by establishing frameworks for profiling archival clinical specimens, ensuring tissue quality prior to ST, and combining spatial data and other complementary modalities to reveal the cellular, molecular and immune-clonal architecture of human cancer.

In Article I, we developed a method that adapted genome-wide spatial transcriptomics to formalinfixed paraffin embedded (FFPE) samples, which constitute the vast majority of clinical specimens, unlocking their potential. The workflow was validated on mouse brain tissue, showing high correlation with matched fresh-frozen data, and then applied on other various tissues to show its robustness across sample types. This development expanded spatial transcriptomics to previously inaccessible FFPE material. We also developed a TSO-based QC assay to assess spatial RNA accessibility directly in FFPE tissue sections, minimizing the risk of failed or biased spatial transcriptomics analysis.

In Article II, we developed an assay that enables evaluation of RNA integrity directly within tissue sections, the spatial RNA integrity number (sRIN) assay. Traditional RIN values are obtained from bulk tissue and therefore cannot reveal local variability in RNA quality. sRIN was developed as a practical quality-control step allowing users to identify well-preserved versus degraded regions before committing to costly downstream experiments.

In Article III, we analyzed genomic and clinical data from phase III melanoma trials and used NMF to define seven melanoma subtypes reflecting distinct differentiation states. By integrating bulk, single-cell, and spatial transcriptomics, we showed that these states coexist within tumors. Our analyses revealed that only differentiated melanoma becomes sensitized to immune checkpoint blockade therapy when combined with BRAF/MEK inhibition through enhanced antigen presentation, whereas undifferentiated states remain resistant, colocalize with CAF-rich niches, and could potentially be targeted by CDK7 inhibitors.

In Article IV, we combined single-cell RNA-seq, spatial transcriptomics and spatial V(D)J profiling to characterize the spatial and clonal organization of the immune landscape of sinonasal squamous cell carcinoma (SNSCC). Although immune infiltration was extensive, T- and B- cell clones were found preferentially within antigen presenting cell -rich stromal and peritumoral niches rather than undifferentiated tumor areas. We identified diverse CD8+ T-cell activation states that followed a bifurcated differentiation trajectory, and we also found an unusually large population of FOXP3+ regulatory T cells (Tregs), many expressing CXCR3 and TBX21 (T-bet). Integration of spatial gene expression with sV(D)J associated immune diversification and clonal expansion with CAF-associated matrix remodeling programs and interferon-activated antigen presenting cell programs. CXCL9+/CXCL10+ macrophages were found as drivers of lymphocyte recruitment and IDO1+ regulatory dendritic cells as immunosuppressive within the same niches.

Spatial transkriptomik (ST) har revolutionerat studiet av genuttryck i vävnadssnitt, men dess till-lämpning på kliniskt relevant material har länge begränsats av tekniska hinder kopplade till provets egenskaper och RNA-kvalitet. Denna avhandling utvecklar användningen av spatial transkriptomik genom att etablera ramverk för profilering av arkiverade kliniska prov, säkerställa vävnadskvalitet före ST och kombinera spatiala data med andra kompletterande modaliteter för att belysa den cellulära, molekylära och immun-klonala arkitekturen i human cancer.

I Artikel I utvecklade vi en metod som anpassade genomomfattande spatial transkriptomik till formalinfixerade paraffininkapslade (FFPE) prover, vilka utgör majoriteten av kliniska vävnader, och därmed frigjorde deras potential. Arbetsflödet validerades på mus-hjärnvävnad, där vi observerade hög korrelation med motsvarande färskfrusna data, och tillämpades därefter på olika andra vävnadstyper för att visa metodens robusthet. Denna utveckling utökade ST till tidigare otillgängligt FFPE-material. Vi utvecklade även ett TSO-baserat QC-test för att bedöma rumslig RNA-tillgänglighet direkt i FFPE-vävnadssnitt, vilket minimerar risken för misslyckad eller snedvriden ST-analys.

I Artikel II utvecklade vi ett test som möjliggör bedömning av RNA-integritet direkt i vävnadssnitt – det spatiala RNA-integritetsnumret (sRIN). Traditionella RIN-värden erhålls från bulkvävnad och kan därför inte avslöja lokal variation i RNA-kvalitet. sRIN utvecklades som ett praktiskt kvalitetskontrollsteg som gör det möjligt att identifiera välbevarade respektive degraderade regioner innan man investerar i kostsamma efterföljande experiment.

I Artikel III analyserade vi genomiska och kliniska data från fas III-studier på melanom och använde NMF för att definiera sju melanomsubtyper som återspeglar distinkta differentieringsstadier. Genom att integrera bulk-, enkelcells- och spatial transkriptomik visade vi att dessa tillstånd samexisterar inom tumörer. Våra analyser visade att endast differentierat melanom blir känsligt för immuncheckpoint-blockad när behandlingen kombineras med BRAF/MEK-hämning via ökad antigenpresentation, medan odifferentierade tillstånd förblir resistenta, samlokaliserar med CAFrika nischer och potentiellt kan riktas med CDK7-hämmare.

I Artikel IV kombinerade vi enkelcells-RNA-sekvensering, spatial transkriptomik och långläsande spatial V(D)J-sekvensering för att karaktärisera immunlandskapet i sinonasalt skivepitelcarcinom (SNSCC). Vi identifierade olika CD8⁺ T-cellsaktiveringsstadier och en ovanligt stor population av FOXP3⁺ regulatoriska T-celler, många med uttryck av CXCR3 och TBX21 (T-bet). Integrering av spatialt genuttryck med sV(D)J kopplade immun diversifiering och klonal expansion till CAF-associerade matrix-remodelleringsprogram och interferonaktiverade antigenpresenterande cellprogram. CXCL9⁺/CXCL10⁺ makrofager identifierades som drivande för lymfocytrekrytering, medan IDO1⁺ regulatoriska dendritiska celler utgjorde immunsuppressiva komponenter inom samma nischer.