Nucleic Acid Amplification Tests (NAATs) with PCR technology to amplify DNA, are the golden standard for infectious disease diagnostics, but they require benchtop instruments and trained users to be performed. For this reason, we all had to send PCR test to centralized laboratories during the Covid-19 pandemic. A year into the pandemic, home-based antigen paper-based tests became available for Covid, but these were not as sensitive, so PCR tests had to be used still. This development emphasized the need for technologies that enable NAATs with superior sensitivity to be performed at home. There are three technological advanced that could make such tests possible: 1)  Paper based devices, called paper microfluidics, have been developed to enable more advanced steps of testing without laboratory equipment. These paper-based system incorporate advanced functionality and multiple reaction steps. 2) New DNA amplification techniques, called isothermal amplification, have been developed which, contrary to PCR, can be run without a thermocycler, enabling DNA amplification to be carried out even inside a paper.  3) Several methods to detect DNA have been shown using paper.

One step that is still largely unsolved in NAATs is the sample preparation step, hindering the development of fully paper-based NAATs. In sample preparation, nucleic acids are extracted from bacteria or virus, usually using reagents harmful to DNA amplification. These steps are thereofore complicated and require several washing steps and heating, and are therefore difficult to integrate into paper.

In this thesis, we used a simple, cost-effective, and scalable method to incorporate sample preparation in paper, thus taking NAATs towards point of care. We solve this problem by immobilizing enzymes that are used for sample preparation on nitrocellulose paper. The immobilized enzymes remain functional and can be used for biochemical reactions, while they are strongly bound to the paper. This method enables the separation of these enzymes from the sample, protecting downstream sensitive reactions of DNA amplification and eliminates the need for high temperature deactivation or washing steps. Specifically, we show that the enzyme achromopeptidase can do cell lysis from the Staphylococcus epidermidis bacteria, a common pathogenic gram-positive bacterium, and use its DNA in further reaction to perform a sample-to-answer paper-based NAAT. These NAATs employed a low temperature amplification step called Recombinase Polymerase Amplification (RPA) and DNA detection with a lateral flow strip.

We further show the enzyme proteinase K, also immobilized on paper, can digest RNase in saliva samples, an enzyme that breaks down RNA leading to false-negative results. This results enabled an easy sample preparation step towards saliva viral DNA self-testing.

Finally, in this work we developed a paper microfluidic system that can carry out an enzyme-linked oligonucleotide assay, which demonstrated much higher sensitivity in detecting amplified DNA than conventional lateral flow assays. In summary, these results provide solutions towards high-performing, affordable and instrument-free paper-based NAATs home-testing.

DNA tester också kallade NAAT tester, utförs idag med PCR-teknik, som först detekterar en specifik DNA och sedan replikerar den för detektion av infektionssjukdomar. PCR tester kräver dock instrument och utbildade personal. Av denna anledning var vi alla tvungna att skicka PCR-test till centraliserade laboratorier under COVID-19-pandemin. Ett år in i pandemin blev antigen pappersbaserade tester tillgängliga för hemtestning, men dessa var fortfarande inte tillräckligt känsliga och PCR-testerna behövde fortfarande användas. Denna utveckling visade behovet av att tillgängliggöra NAAT för hemmabruk. Det har på senare tid gjorts tre tekniska framsteg som för oss närmare sådana tester:_1) Pappersbaserade tester, så kallade pappers mikrofluidik, har utvecklats, för att möjliggöra mer avancerade tester. Dessa pappersbaserade system innehåller avancerad funktionalitet och flera reaktionssteg. 2) Nya DNA-amplifieringstekniker som kallas isotermisk amplifiering har utvecklats. Dessa kan i motsats till PCR köras utan maskiner, under konstant temperatur, och därmed blir DNA-amplifiering möjlig att utföra även inuti ett papper. 3) Flera metoder för att detektera DNA-metoder har visats med papper.

Ett steg som fortfarande inte är helt löst är provberedningssteget för NAAT. I provberedningen extraheras nukleinsyror från bakterier eller virus, vanligtvis genom användning av reagenser som är förstörr DNA-amplifiering. Provbredning är därför komplicerade. Dom kräver flera tvättsteg och uppvärmning och är därför svåra att integrera i papper.

I det här arbetet använde vi en enkel, kostnadseffektiv och skalbar metod för att integrera provberedning i papper. Våra resultat tar oss ett steg närmare DNA självtestning. Vi löser problemet med provbredning genom att immobilisera relevanta enzymer på nitrocellulosapapper. Dessa immobiliserade enzymer förblir funktionella och kan sedan utföra biokemiska reaktioner, samtidigt som de är starkt bundna till papperet. Denna metod möjliggör separation av provbredningssenzymer från, andra känsliga reaktioner såsom DNA-amplifiering. Samtidigt elimineras behovet av högtemperaturdeaktivering eller tvättsteg. Vi visar specifikt att enzymet akromopeptidas kan ta sönder cellväggen för att extrahera DNA hos Staphylococcus-epidermidis bakterien, en vanlig patogen, och vi kan sedan direkt använda bakteriens DNA i ytterligare reaktion för att utföra en prov-till-svar pappersbaserad DNA test. Dessa tester använder lågtemperatur för amplifieringssteget med en teknik som kallas Recombinase Polymerase Amplification (RPA) och vi utför DNA-detektion med en paperbaserad flödesremsa.

Vi visar vidare att enzymet proteinas K också kan immobiliseras på papper för att sedan förstora RNas:er, ett enzym som bryter ner RNA och som finns i humana salivprover. Möjligheten att använda papper för att ta bort RNAs från saliv öppnar vägen mot självtestning av salivvirus-DNA, som influenza virus.

Slutligen, utvecklade vi ett pappersmikrofluidik system som kunde utföra en enzymkopplad oligonukleotid test. Denna test visar mycket högre känslighet för detektering av amplifierat DNA än vad en kommersiell paperbaserad flödesremsa visar. 

Sammanfattningsvis har denna avhandlig visat några olika lösningar som för oss närmare prisvärda och instrumentfria pappersbaserade DNA tester för hemanvändning.