Engineering naturally occurring proteins enables us to customize affinity domains according to our specific needs, tailoring them to become an important tool in a wide array of applications limited merely by our creativity. One of nature’s ways to regulate protein activity is by creating a functional change through alteration of a protein’s tertiary structure upon interaction with metal ions. Inspired by this elegant solution, this thesis has focused on engineering calcium-regulated affinity proteins using two different strategies and protein scaffolds.

The first strategy revolved around designing and selecting a calcium- binding motif that can render the inherent target affinity of a naturally occurring protein domain to be turned on or off depending on whether calcium is present or not. The subject of this part of the thesis was one of the immunoglobulin-binding domains derived from Streptococcal Protein G. A library of various loops with prerequisites for attracting calcium was inserted between the IgG-binding surfaces of the domain prior to performing cell display selections aimed for rendering the inherent target interaction dependent on the presence of calcium. Successful selections resulted in a calcium-dependent version of the IgG-binding protein and its structure could be solved using NMR. A deeper investigation of the incorporated structural calcium-dependency could explain the underlying mechanisms giving rise to the functional on-and-off switch in target affinity and show how it derived from the evolutionary selection pressures applied.

The second strategy included the creation of a combinatorial library based on a calcium-dependent protein scaffold, derived from Staphylococcal Protein A, for development of small calcium-regulated affinity – CaRA –imolecules with novel target specificities. Mimicking the multifaceted usefulness of naturally occurring metalloproteins, this second part of the thesis aimed at performing phage display selection campaigns towards a diverse set of targets relevant for various applications from bioprocessing (e.g. scFv) to biological therapies (e.g. TNFa, IL-23, EGFR). When evaluating the binding properties in the presence and absence of calcium, all discovered CaRA variants display calcium-dependent binding and target affinities in the nanomolar range.

Engineering conditional binding can enhance the potential of next generation therapies in several ways. When used as calcium-dependent affinity ligands, it enables mild purification at neutral pH of therapeutic antibodies and antibody fragments that was previously limited by harsh acidic elution conditions. Reducing the risk of aggregated product by eluting at neutral pH would result in improved safety as well as the possibility to manufacture a greater repertoire of antibody formats. Furthermore, the conferred calcium- dependency of the CaRA scaffold can be used in a therapeutic approach envisioned to result in increased tissue penetration due to its small size and improved intracellular delivery by taking advantage of the existing calcium- gradient across the endosomal membrane of cells. This could lead to higher therapeutic efficacy by enabling lower doses or dosing frequency, further advancing a more patient-friendly future.

När biologi kombineras med ingenjörers strukturerade tankesätt kan naturligt förekommande proteiner förvandlas till användbara verktyg, skräddarsydda för en mängd olika applikationer som endast verkar begränsas av vår fantasi.

Naturligt förekommande proteiner har oftast en dedikerad funktion, en uppgift att utföra, och aktivitetsgraden kan styras genom förändringar i proteinets struktur via interaktion med andra småmolekyler, såsom exempelvis metalljoner. Inspirerad av naturens eleganta lösningar utforskar denna avhandling olika tillvägagångssätt för att konstruera metallreglerade proteiner vars interaktion med ett målprotein kan slås på eller stängas av genom tillgång till kalcium.

Den första strategin kretsar kring att förädla ett existerande protein som redan kan känna igen och interagera med antikroppar till att endast kunna upprätthålla den förmågan i närvaro av kalcium. Tack vare banbrytande molekylärbiologiska tekniker som möjliggjort att vi idag kan klippa och klistra i arvsmassa (DNA) så finns möjligheten att infoga och kombinera gener som uttrycker olika proteinfunktioner. I detta fall kombinerades ett protein som molekylärt kan känna igen och har affinitet för vissa antikroppar med diverse strukturella motiv som kan binda kalcium. För att lyckas utveckla ett kalciumbindande motiv som kan påverka den existerande affiniteten till antikroppar byggdes ett bibliotek med olika motiv med olika förutsättningar för att attrahera kalciumjoner och detta infogades mellan de antikroppsbindande ytorna på proteinet, i hopp om att strukturen och funktionen hos proteinet skulle kunna regleras genom inbindningen av kalcium. Biblioteket genomsöktes efter varianter som uppvisade den eftersökta förmågan, kalciumberoende interaktion med antikroppar, och viiiihittade flera varianter som uppfyllde detta. Genom att undersöka proteinstrukturen på en av dessa nya kalciumberoende antikroppsbindande varianter så kunde vi förklara de underliggande mekanismerna i strukturen som gör att proteinets funktion regleras med hjälp av kalcium.

Vår andra strategi för att konstruera kalciumberoende proteiner är mer generell och syftar till att använda ett bibliotek med proteinvarianter som redan har förmågan att binda kalcium men som kan utvecklas till att interagera med andra molekyler än antikroppar. Vår vision är att kunna utveckla kalciumreglerad affinitet för vilket målprotein som än önskas och hittills har vi utvecklat flera proteiner vars affinitet för sin specifika målmolekyl kan regleras med hjälp av kalcium.

Det finns många tillämpningar där det kan vara användbart att ha ett protein vars funktion kan regleras. En stor del av den moderna läkemedelsutvecklingen drivs av cellfabriker som producerar proteiner, ofta antikroppar, som kan känna igen och hämma cancer eller inflammation när de injiceras i patienter. Cellerna producerar dock andra molekyler som krävs för deras överlevnad samtidigt som de tillverkar antikropparna och därför krävs efterföljande reningssteg som separerar de intressanta proteinerna ifrån biprodukterna. Ett kalciumberoende protein som binder antikroppar kan därför användas för att isolera det potentiella läkemedlet ifrån biprodukterna och därefter lösgöras ifrån antikroppen igen genom borttagning av kalcium.

Proteinbaserad läkemedelsutveckling innebär även fantastiska möjligheter för kreativa terapeutiska strategier. Ett kalciumberoende biologiskt läkemedel kan styras av de naturliga skiftningar i kalciumkoncentration som återfinns i kroppen och exempelvis designas på ett finurligt sätt till att leverera en sjukdomsframkallande molekyl till kroppens egna celler för nedbrytning.ivSammanfattningsvis presenterar denna avhandling olika tillvägagångssätt för att utveckla proteiner vars funktion kan regleras genom tillgången på kalcium för diverse applikationer. Förhoppningsvis kommer dessa kunna bidra till nya tillverkningsprocesser av antikroppsbaserade läkemedel och inspirera till utveckling av framtidens proteinbaserade läkemedel.

Protein therapeutics hold great potential in cancer treatment as they combine specificity with effective delivery to tumor sites, but traditional antibodies face limitations related to size, production cost, and stability. As an alternative, smaller protein scaffolds present a promising approach, offering reduced costs due to production in bacterial hosts, greater stability, and versatile engineering potential for diverse functionalities.

This thesis aims to contribute to the field of engineered scaffold proteins, optimizing the discovery workflow, introducing a new conditional binding scaffold, and evaluating its applicability as protein-drug conjugates for targeted cancer therapies.

The first part of this thesis aims to streamline the discovery pipeline for protein scaffolds. Study I presents an optimized high-throughput phage display system incorporating automated selection and sequencing techniques to discover protein binders efficiently, as demonstrated with the albumin binding domain-derived affinity protein (ADAPT) and Calcium-regulated affinity (CaRA) libraries. This semi-automated system reduces hands-on time and increases robustness, making the discovery process more accessible for labs without high-cost equipment. Results show the possibility of generating high-affinity binders with broad applications in diagnostics and therapeutics. Following the foundation laid by the workflow optimization, Study II introduces the CaRA library more deeply. The library is engineered to provide calcium-dependent and pH-dependent binding capabilities. The library’s design enables conditional interactions, where calcium levels modulate binding. This feature is particularly beneficial for therapeutic applications requiring precise targeting and controlled binding release. The CaRA scaffold demonstrated stability, nanomolar affinities, and calcium-dependent binding across diverse targets, with potential in both therapeutic and biotechnological settings. Study III introduces an accelerated maturation process for conditional binders to further enhance the therapeutic potential of small scaffold proteins. Utilizing deep sequencing data from initial selections with the CaRA library and E. coli display screening, a high-affinity binder for HER3 with pH-dependent binding, CaRA_HER3, was developed. This characteristic allows for rapid release in acidic environments, mimicking endosomal conditions, which could be advantageous for intracellular drug delivery. The final paper, Study IV, focuses on applying CaRA binders in developing protein-drug conjugates for targeted cancer treatment. Specifically, a CaRA-based EGFR binder (CaRA_EGFR) was engineered to bind EGFR conditionally, depending on calcium levels. This calciumregulated binding allows the protein to dissociate in the low-calcium environment of endosomes, potentially enhancing cytotoxic drug delivery directly to tumor cells. Confocal microscopy confirmed that the CaRA_EGFR binder effectively internalizes and trafficks to lysosomes, achieving targeted cytotoxicity in EGFR-expressing cells. This approach highlights the value of conditional affinity in challenges related to the biological fate of receptors, paving the way for more effective, receptor-specific drug delivery systems. This thesis advances protein engineering for small scaffold therapeutics through new discovery workflows and calcium- and pH-dependent binding mechanisms. By advancing new ways to engineer these scaffolds, the findings contribute to developing safer, more effective proteinbased therapies for cancer treatment.

Proteinbaserade läkemedel har stor potential inom cancerbehandling eftersom de kombinerar specificitet med effektiv leverans till tumörområden. Traditionella antikroppar har dock begränsningar kopplade till storlek, produktionskostnad och stabilitet. Som ett alternativ erbjuder mindre proteinscaffolds en lovande metod, med lägre kostnader tack vare produktion i bakterieceller, högre stabilitet och mångsidig möjlighet till anpassning för olika funktioner. 

Denna avhandling syftar till att bidra till området för konstruerade proteinscaffolds genom att optimera upptäcktsprocessen, introducera ett nytt scaffold med villkorlig bindning och utvärdera dess användbarhet som protein-läkemedelskonjugat för riktad cancerbehandling. 

Den första delen av denna avhandling fokuserar på att effektivisera selektionsprocessen för proteinscaffolds. Studie I presenterar ett optimerat high-throughput-fagdisplaysystem som inkluderar automatiserade selektions- och sekvenseringstekniker för att effektivt identifiera proteinerabindare, som exemplifieras med bibliotek av albuminbindande domäner (ADAPT) och kalciumreglerade affinitetsproteiner (CaRA). Detta halvautomatiserade system minskar den manuella arbetsinsatsen och ökar robustheten, vilket gör selektiopnsprocessen mer tillgänglig för laboratorier utan högkostnadsutrustning. Resultaten visar möjligheten att generera högaffinitetsbindare med breda användningsområden inom diagnostik och terapi. Efter optimering av arbetsflödet introducerar Studie II CaRA-biblioteket mer ingående. Biblioteket är designat för att ge kalcium- och pH-beroende bindningsegenskaper, där kalciumnivåerna modulerar bindningen. Denna egenskap är särskilt fördelaktig för terapeutiska applikationer som kräver exakt målstyrning och kontrollerad dissociation. CaRA-scaffoldet uppvisade stabilitet, nanomolära affiniteter och kalciumberoende bindning till olika måll, med potential både inom terapi och bioteknologiska applikationer. Studie III introducerar en accelererad affinitetsmatureringsprocess för villkorliga bindare för att ytterligare förbättra de terapeutiska möjligheterna för små proteinscaffolds. Med hjälp av djupsekvenseringsdata från initiala selektioner med CaRA-biblioteket och E. coli display-screening utvecklades en högaffinitetsbindare för HER3 med pH-beroende bindning, CaRA_HER3. Denna egenskap möjliggör snabb frisättning i sura miljöer, som efterliknar endosomala förhållanden, vilket kan vara fördelaktigt för intracellulär läkemedelsleverans. 

Den sista studien, Studie IV, fokuserar på tillämpningen av CaRA-bindare i utvecklingen av protein-läkemedelskonjugat för riktad cancerbehandling. Specifikt utvecklades en CaRA-baserad EGFR-bindare (CaRA_EGFR) för att binda EGFR villkorligt beroende på kalciumnivåer. Denna kalciumreglerade bindning möjliggör att proteinet dissocierar i den låga kalciumhalten i endosomer, vilket potentiellt ökar cytotoxisk läkemedelsleverans direkt till tumörceller. Konfokalmikroskopi bekräftade att CaRA_EGFR-bindaren effektivt internaliseras  och transporteras till lysosomer, vilket uppnår riktad cytotoxicitet i EGFR-uttryckande celler. Detta tillvägagångssätt understryker värdet av villkorlig affinitet i utmaningar kopplade till receptorernas biologiska öde, och banar väg för effektivare, receptor-specifika läkemedelsleveranssystem. Denna avhandling främjar proteiningenjörskonst för små scaffold-baserade terapeutiska proteiner genom nya upptäcktsarbetsflöden och kalcium- och pH-beroende bindningsmekanismer. Genom att utveckla nya s.tt att konstruera dessa scaffolds bidrar resultaten till säkrare och effektivare proteinbaserade terapier för cancerbehandling.