Carbon dioxide (CO₂) emissions from human activities are driving climate change, but the pending crisis could be mitigated by a circular carbon economy where released CO₂ is recycled into commodity chemicals. Autotrophic microbes can make a contribution by producing chemicals, such as biofuels, from CO₂ and renewable energy. The primary natural CO₂ fixation pathway is the Calvin cycle, in which the enzyme Rubisco carboxylates ribulose-1,5-bisphosphate. The present investigation used computational systems biology methods to map adaptations and constraints in autotrophic microbial metabolism based on the Calvin cycle. First, the metabolic network of the Calvin cycle-capable photoautotrophic cyanobacterium Synechocystis was contrasted with that of heterotrophic E. coli. Intracellular metabolite concentration ranges differed, leading to different capacity to provide thermodynamic driving forces to chemical production pathways. Second, the Calvin cycle in Synechocystis was modeled kinetically, showing that certain enzyme saturation and metabolite levels, for example high ribulose-1,5-bisphosphate concentration, were detrimental to stability. Control over reaction rates was distributed, but making certain enzymes faster, for example fructose-1,6-bisphosphatase, could increase overall carbon fixation rate. Third, Synechocystis was starved of CO₂ and ribosome profiling was used to track the effect on translation. Stress response and CO₂ uptake were upregulated, but constant Rubisco expression and ribosome pausing in 5' untranslated regions indicated readiness for reappearance of CO₂. Finally, microbial genomes with and without the Calvin cycle were contrasted, revealing metabolic, energetic, and regulatory adaptations that describe the properties of a functional autotroph. These findings provide a background for future study and engineering of autotrophs for direct conversion of CO₂ into commodity chemicals.

Utsläpp av koldioxid (CO₂) från mänskliga aktiviteter driver klimatförändringarna, men den stundande krisen skulle kunna mildras av en cirkulär kolekonomi där CO₂ som släpps ut återvinns till råvarukemikalier. Autotrofa mikrober kan bidra genom att producera kemikalier, såsom biobränslen, från CO₂ och förnybar energi. Den primära naturliga syntesvägen för CO₂-fixering är calvincykeln, i vilken enzymet Rubisco karboxylerar ribulos-1,5-bisfosfat. Undersökningen som ligger till grund för denna avhandling använde systembiologiska beräkningsmetoder för att kartlägga anpassningar och begränsningar i autotrof mikrobiell metabolism baserad på calvincykeln. För det första kontrasterades det metaboliska nätverket hos den calvincykelkapabla fotoautotrofa cyanobakterien Synechocystis med det hos heterotrofen E. coli. De intracellulära metabolitkoncentrationerna var olika, vilket ledde till olika kapacitet att bistå med termodynamisk drivkraft till kemiska syntesvägar. För det andra modellerades calvincykeln i Synechocystis kinetiskt, vilket visade att vissa enzymsatureringsnivåer och metabolitkoncentrationer, bland annat hög ribulos-1,5-bisfosfatkoncentration, motverkade stabiliteten. Kontroll över reaktionshastigheter var distribuerad, men ökning av hastigheten hos vissa enzymer, till exempel fruktos-1,6-bisfosfatas, skulle kunna öka den generalla kolfixeringshastigheten. För det tredje svältes Synechocystis på CO₂ och ribosomprofilering användes för att följa effekten på translationen. Stressrespons och CO₂-upptag uppreglerades, men konstant uttryck av Rubisco och pausning av ribosomer i de icketranslaterade 5'-regionerna indikerade beredskap för ett återuppträdande av CO₂. Slutligen jämfördes mikrobiella genom med och utan calvincykeln, vilket avslöjade metaboliska, energetiska, och regulatoriska anpassningar som beskriver egenskaperna hos en funktionell autotrof. Dessa upptäckter ger en bakgrund för framtida studier och ingenjörsmässig design av autotrofer för direkt omvandling av CO₂ till råvarukemikalier.

Earth has entered a new geological epoch, the Anthropocene, defined by humanity’s impact on the environment with increased emissions of CO2 due to burning of fossil resource as a major contributor. To ensure a sustainable future, humanity has to move towards a circular economy, where released CO2 is re-captured and turned into resources. Biological CO2 fixation performed by autotrophic microorganisms using renewable energy can thereby play an important role, but requires improvement in capacity and efficiency. To enable targeted improvements, computational methods in systems biology and metabolic engineering were used in this thesis to identify thermodynamic and kinetic constraints of autotrophic microorganisms using the Calvin cycle as their primary CO2 fixation pathway. In Paper I, the different metabolic networks of the photoautotrophic cyanobacterium Synechocystis and the heterotrophic E. coli were compared, revealing network- specific intracellular metabolite concentration ranges and thermodynamic driving forces, causing different capabilities for production of industrially relevant chemicals. For Paper II, a kinetic metabolic model of the Calvin cycle in Synechocystis was developed and analyzed, exposing factors favoring a stable operation, such as a low concentration of Ribulose 1,5-phosphate or low saturation states of many enzymes towards their substrates. It furthermore revealed that control over the reaction rates in the Calvin cycle was distributed, but the CO2 fixation rate could be increased by higher rates through enzymes such as fructose 1,6-bisphosphatase or phosphoglycerate kinase. In Paper III, experimentally determined interactions between metabolites and proteins in several autotrophic microorganisms were tested for their regulatory functions. For Synechocystis, these interactions were interpreted in the metabolic context by integrating them in an expanded kinetic model, revealing significant shifts in metabolome stability when biochemical regulation was added to transketolase, an enzyme central to the Calvin cycle, but only minor effects on flux control. Lastly, for Paper IV the thermodynamic landscape of Cupriavidus necator and its natural capacity of producing the bioplastic PHB were evaluated. Different substrate utilization scenarios and metabolic engineering strategies were simulated using a metabolic model, revealing substrate-independent thermodynamic constraints and contrasting effects of the engineering efforts. This work provides the knowledge for further studies and targeted engineering efforts aiming to alleviate constraints on autotrophic metabolism to improve its performance in transforming CO2 into usable resources.

Jorden har gått in i en ny geologisk epok, Antropocenen, definierad av mänsklighetens påverkan på miljön. Förbränningen av fossila resurser och det resulterande utsläppet av koldioxid driver klimatförändringar, en av mänsklighetens största utmaningar någonsin. För att säkerställa en hållbar framtid måste mänskligheten sträva till en cirkulär ekonomi, där utsläppt koldioxid återfångas och återförvandlas till resurser. Biologisk koldioxid-fixering, utförd av autotrofa mikroorganismer med förnybar energi, kan spela en viktig roll i denna processen, men kräver förbättring av kapacitet och effektivitet av den autotrofa metabolismen. Beräkningsmetoder inom systembiologi har använts i denna avhandling för att identifiera termodynamiska och kinetiska begränsningar för autotrofa mikroorganismer med calvincykeln som deras primära koldioxid-fixeringsväg, som kan bidra att möjliggöra konkreta förbättringar av metabolismen. Först jämfördes de olika metaboliska nätverken för den fotoautotrofa cyanobakterien Synechocystis och den heterotrofa bakterien E. coli, som resulterade i nätverksspecifika metabolitkoncentrationer och termodynamiska drivkrafter, vilket orsakade olika kapacitet för produktionen av industriellt relevanta kemikalier. För det andra utvecklades och analyserades en kinetisk metabolisk modell av calvincykeln i Synechocystis, som avslöjade faktorer som möjliggör en stabil funktion av metabolismen, såsom en låg koncentration av Ribulose 1,5-fosfat eller låga enzymsatureringsnivåer för många enzymer för deras substrat. Det visades dessutom att kontrollen över reaktionshastigheterna i calvincykeln var distribuerad, men CO2- fixeringshastigheten kan ökas med högre hastigheter genom enzymer som fruktos 1,6-bisfosfatas eller fosfoglyceratkinas. För det tredje testades experimentellt bestämda interaktioner mellan metaboliter och proteiner i flera autotrofa mikroorganismer för deras reglerande funktioner. För Synechocystis tolkades dessa interaktioner i det metaboliska sammanhanget genom att integrera dem i en utökad kinetisk modell, vilket avslöjade betydande förändringar i metabolomstabilitet när biokemisk reglering tillsattes till transketolas, ett enzym som är centralt för clavincykeln, men endast mindre effekter på kontroll över reaktionshastigheterna. Slutligen utvärderades för det fjärde det termodynamiska landskapet i Cupriavidus necator och dess naturliga kapacitet att producera bioplasten PHB. Olika substratanvändningsscenarier och strategier för att modifiera metabolismen simulerades med hjälp av en metabolisk modell, vilket avslöjade substratoberoende termodynamiska begränsningar och kontrasterande effekter av de modifierarna. Denna avhandling ger kunskap för ytterligare studier och riktade modifierar av metabolismen som syftar till att lindra begränsningar för den autotrofa metabolismen för att förbättra dess prestanda vid omvandling av CO2 till användbara resurser.

Der Planet Erde ist in eine neue geologische Epoche eingetreten, das Anthropozän, definiert durch die Auswirkungen der Menschheit auf die Umwelt. Der Anstieg der CO2-Konzentration in der Atmosphäre, versursacht durch die Verbrennung fossiler Ressourcen, ist hauptverantwortlich für die Klimakrise. Um eine nachhaltige Zukunft zu gewährleisten ist eine zirkuläre Wirtschaft essenziell, in der freigesetztes CO2 wieder aufgefangen und in Ressourcen umgewandelt wird. Die biologische Aufnahme von CO2 durch autotrophe Mikroorganismen kann dabei eine wichtige Rolle spielen, erfordert aber eine Verbesserung der Kapazität und Effizienz des Stoffwechsels. In der vorliegenden Arbeit wurden computergestützte Methoden der Systembiologie verwendet um thermodynamische und kinetische Limitationen autotropher Mikroorganismen zu identifizieren, die den Calvin-Zyklus als primären CO2-Fixierungsweg verwenden. Mit diesen Informationen können Strategien entwickelt werden um diese Limitationen gezielt aufzuheben oder abzuschwächen. Dazu wurden zuerst die unterschiedlichen metabolischen Netzwerke des photoautotrophen Cyanobakteriums Synechocystis und des heterotrophen Bakteriums E. coli verglichen, wobei netzwerkspezifische Metabolitkonzentrationen und thermodynamische Triebkräfte aufgezeigt wurden. Daraus folgte die unterschiedliche Fähigkeiten zur Produktion industriell relevanter Chemikalien. Als zweites wurde ein kinetisches Modell des Calvin-Zyklus für Synechocystis entwickelt und analysiert. Faktoren für eine robuste Funktion des Stoffwechsels wurden aufgezeigt, wie zum Beispiel eine niedrige Konzentration von Ribulose 1,5-Phosphatoder niedrige Sättigungszustände vieler Enzyme. Es zeigte sich außerdem, dass die Kontrolle über die Reaktionsgeschwindigkeiten im Calvin-Zyklus auf mehrere Reaktionen verteilt war, die CO2-Fixierungsgeschwindigkeit jedoch durch höhere Reaktionsgeschwindigkeiten durch Enzyme wie Fructose-1,6-Bisphosphatase erhöht werden konnte. Als drittes wurden experimentell ermittelte Interaktionen zwischen Metaboliten und Proteinen in mehreren autotrophen Mikroorganismen auf ihre regulatorischen Funktionen getestet. Für Synechocystis wurden diese Interaktionen in ihrem metabolischen Kontext interpretiert, indem sie in ein erweitertes kinetisches Modell integriert wurden. Es wurden signifikante Verschiebungen in der Metabolomstabilität aufgezeigt, wenn die biochemische Regulation zu Transketolase, einem zentralen Enzym des Calvin-Zyklus, hinzugefügt wurde. Auswirkungen auf die Kontrolle der Reaktionsgeschwindigkeiten waren nur gering. Viertens wurde die Verteilung von thermodynamische Triebkräften in Cupriavidus necator und dessen natürliche Fähigkeit zur Produktion des Biokunststoffs PHB evaluiert. Unter Verwendung eines Computermodells wurden verschiedene Substratnutzungsszenarien und Interventionsstrategien simuliert, wodurch substratunabhängige thermodynamische Limitationen und gegensätzliche Auswirkungen der Interventionsstrategien identifiziert wurden. Diese Arbeit liefert die Grundlage für weitere Studien und gezielte technische Bemühungen mit dem Ziel die Grenzen des autotrophen Stoffwechsels zu erweitern und um die Umwandlung von CO2 in nutzbare Ressourcen zu verbessern.