Transcriptomics promises biological insight into gene regulation, cell diversity, and mechanistic understanding of dysfunction. Driven by technological advancements in sequencing technologies, the field has witnessed an exponential growth in data output. Not only has the amount of raw data increased tremendously but it’s granularity as well. From only being able to obtain aggregated transcript information from large tissue samples, we can now pinpoint the precise origin of transcripts within the tissue, sometimes even within the confines of individual cells. This thesis focuses on the different aspects of how to use these emergent technologies to obtain a greater understanding of biological mechanisms. The work conducted here spans only a few years of the much longer history of spatially resolved transcriptomics, which started with the early in situ hybridization techniques and will continue to a potential future with complete molecular profiling ofevery cell in their natural, active state. Thus, at the same time the workpresented here introduces and demonstrates the use of the latest techniques within spatial transcriptomics, it also deals with the shortcomings of the current state of the field, which undoubtedly will see extensive improvements in the not too distant future. Article I is part of a series of articles where we mechanistically examine the biological underpinnings of a serendipitous finding that single-stranded nucleic acids have immunomodulatory effects. In particular, we look at influenza-infected innate immune cells and the ability of the oligonucleotide to inhibit viral entry. The oligonucleotides prevent the cells from responding to certain types of pattern recognitionand cause a decrease in viral load. Our hypothesis is that the administration of oligonucleotides blocks certain endocytic routes. While the invivo experiments suggest that the influenza virus is still able to infect and promote disease in the host, changes in signaling response due to the inhibition of the endocytotic routes could represent an avenue for future therapeutics. The conclusions were drawn by combining protein labeling and conventional methods for RNA profiling in the form of quantitative realtime PCR and bulk RNA sequencing. As a transition into the concept of spatial RNA profiling, the thesis includes an Additional material review article on spatial transcriptomics, where we give an overview of the current state of the field, as it looked like in the beginning of 2020. In Article II, we report on the development of an R package for analyzing spatial transcriptomics datasets. The package offers visualization features and an automated pipeline for masking tissue images and aligning serially sectioned experiments. The tool is extensively used throughout the rest of the articles where spatial transcript information is analyzed and is available for all scientists that use the supported spatial transcriptomics platforms in their research. In Article III, we propose a method to spatially map long-read sequencing data. While previously described methods for high-throughput spatial transcriptomics produce short-read data, full-length transcript information allows us to spatially profile alternatively spliced transcripts. Using the proposed method, we find alternatively spliced transcripts and find isoforms of the same gene to be differentially expressed in different regions of the mouse brain. Furthermore, we profile RNA editing across the full-length transcripts and find certain parts of the mouse left hemisphere to display a substantially higher degree of editing events compared to the rest of the brain. The proposed method is based on readily available reagents and does not require advanced instrumentation. We believe full-length transcript information obtained in this manner could help scientists obtain a deeper understanding from transcriptome data. Finally, in Article IV, we explore how the latest technologies for spatial transcriptomics can be used to characterize the expression landscape of respiratory syncytial virus infections by comparing infected and non-infected mouse lungs. By integration of annotated single-cell data and spatially resolved transcriptomics, we map the location of the single cells onto the spatial grid to localize immune cell populations across the tissue sections. By correlating the locations to gene expression, we profile locally confined cellular processes and immune responses. We believe that high-throughput spatial information obtained without predefined targets will become an important tool for exploratory analysis and hypothesis generation, which in turn could unlock mechanistic knowledge of the differences between experimental models that are important for translational research.

Läran om genuttryck tros kunna ge kunskap kring celldiversitet och en ökad mekanistisk förståelse för dysregulation. Detta fält, benämnt transkriptomik, har sett exponentiell tillväxt i mån av genererad data på senare år, till stor del drivet av teknologiska framsteg. Inte bara den råa mängden data har ökat, utan även förmågan att särskilja vilka celler som informationen om generna kommer ifrån. Historiskt har sådan information endast observerats utifrån större vävnadsbitar, och således har ett medelvärde över flertalet celler observerats, utan att veta från vilka celler de individuella observationerna härstammar eller cellernas inbördes lokalisation. Denna avhandling kretsar kring de nya metoderna för spatiell analys av transkriptomet, vilka möjliggör positionering av vart någonstans i vävnaden genuttrycket sker och på så vis ger den granularitet som verklig mekanistisk förståelse ofta kräver. Det arbete som presenteras här spänner endast över några år av den längre bana som utvecklingen av spatiell transkriptomik befinner sig på, från de tidiga experimenten av in situ hybridisering till en potentiell framtid med komplett molekylär profilering av varje cell i deras naturliga miljö. Då det senare än ej är realiserat idag, behandlar avhandlingen och de inkluderade arbeten även tillkortakommanden i dagens teknik. Detta fält är under mycket snabb utveckling, och flera av de svagheter som finns idag tros vara kraftigt förminskade inom en relativt snart framtid. Artikel I är en del av en serie av artiklar där vi mekanistiskt undersöker ett fenomen där enkelsträngade nukleinsyror medför immunomodulativa effekter. Mer specifikt undersöker vi i den aktuella artikeln hur oligonukleotider av särskild längd påverkar influenzainfekterade dendritiska celler och viruspartiklarnas möjlighet att ta sig in i dessa celler. Vi finner inhibering av cellernas förmåga att respondera till särskild mönsterigenkänning samt minskade virusmängder direkt efter administration av oligonukleotider. Vår hypotes är att detta är en effekt av blockering av särskilda endocytotiska vägar. Experiment i möss tyder på att influensaviruset fortfarande är kapabelt att infektera och medföra sjukdom hos djuren, men resultatet av att blockera de endocytotiska upptagsvägarna för viruset medför förändrad signalering, vilket kan utgöra en intressant möjlighet för terapeutiska interventioner. Slutsatserna dras genom att kombinera protein-infärgning och konventionella metoder för analys av transkriptomet, i form av kvantitativ realtids-PCR och bulk-RNA-sekvensering. En övergång till spatiell analys görs sedan, där en review på ämnet är inkluderad i avhandlingen som en bilaga, och fungerar som översikt över alla de metoder som tagits fram för att möjliggöra denna typ av analys, så som det såg ut i början av 2020. I Artikel II visar vi utvecklingen av en mjukvara skriven i R för sekvensbaserad spatiell transkriptomik. Mer specifikt adderar vi visualiseringsmöjligheter och en automatiserad pipeline för bildhantering. Verktyget är öppet tillgängligt för alla som använder de spatiella transkriptomik-plattformarna som stöds. I Artikel III vidareutvecklar vi protokollet för spatiell transkriptomik för att kunna utnyttja de teknologiska framstegen som skett inom sekvensering av fullängds-transkriptomik. Genom att läsa av hela transkript istället för endast kortare bitar, som är standard idag, kan transkriptomets fulla komplexitet analyseras. Exempelvis visar vi hur kvantiteter av olika isoformer av en och samma gen skiljer sig markant mellan olika regioner i mushjärnan samt hur vissa typer av RNA-förändringar är vanligare i olika regioner. Det föreslagna protokollet använder enkelt tillgängliga reagenser och kräver ingen avancerad mätutrustning. Vi tror att fullängds-information kommer att vara avgörande för att uppnå komplett biologisk förståelse utifrån transkriptomdata. Slutligen, i Artikel IV, använder vi de senaste metoderna för spatiell transkriptomik för att undersöka hur den lokala miljön i lungan påverkas av en viral infektion genom att jämföra genuttrycket mellan infekterade och icke-infekterade möss. Genom att integrera publikt tillgänglig annoterad data från enskilda celler me spatiell transkriptomdata, kartlägger vi hur olika typer av immunceller lokaliserar sig över vävnadssnitten. Genom att korrelera genuttryck och celltypernas position, skapar vi en uttömmande bild över hur olika cellulära processer och immunresponser uppvisar lokala anpassningar. Vi tror att storskalig spatial information utan fördefinierade val kring vilka gener som undersöks kommer att utgöra ett viktigt verktyg för explorativ analys och hypotesgenerering.  

Over the past few decades, the advent of pioneering biotechnological methods has allowed scientists to analyze the molecular components of multicellular organisms with remarkable precision. The field of transcriptomics has witnessed a rapid development of technologies for gene expression profiling of biological samples. These gene expression profiles offer crucial insights into biological processes that underlie organism development, homeostasis, and disease-causing dysregulation. Modern transcriptomics technologies can profile samples at various degrees of precision and resolution, and when combined, they contribute to a comprehensive understanding of the complex molecular mechanisms that shape entire organisms. Some of these molecular mechanisms occur at the microscopic scale, controlled by communication between nearby cells. Other mechanisms depend on coordinated efforts between large networks of cells organized into tissues and organs. Cells, tissues and organs represent hierarchical levels of structural organization, and each level plays a vital role in the proper functioning of the organism. Gene expression profiling technologies yield comprehensive data that can be harnessed to explore and characterize biological phenomena within and across these structural levels. The central theme of this thesis revolves around the use of experimental technologies and computational methods in the field of transcriptomics to enhance our understanding of multicellular life. Particular attention is directed at a technology known as Visium, which has held an important position in the field in recent years. The research articles included in this thesis demonstrate the applications of Visium and related technologies in biological research.

In article I, we present a computational toolbox for processing, analyzing, and visualizing Visium data, assembled into an open-source package written in the R programming language. The package facilitates the characterization of gene expression profiles in tissue sections and seamlessly integrates expression data with corresponding histological images. This computational framework was used extensively for the data analyses presented in articles II, III and IV and the articles listed in the extended list of publications.

In article II, we report one of the first spatiotemporal, transcriptomics atlases of the developing human heart. The atlas encompasses three developmental time points during the first trimester, and is constructed from gene expression data from isolated cells and intact tissue sections. Joint analysis of this data enabled characterization of the transcriptomic profiles and the cellular composition of anatomical domains within the heart, illuminating biological processes that underlie cardiac morphogenesis in humans.

Article III constitutes a study of the transcriptomic landscape of the murine colon generated using spatially resolved transcriptomics. By folding the organ into a roll, we successfully obtained tissue sections covering the entire colon, enabling organ-wide transcriptomic profiling. Sections were acquired from a healthy colon and a colon recovering from damage due to treatment with a tissue-damaging substance. Data-driven analysis of the healthy colon unveiled a previously undiscovered molecular regionalization from the proximal to distal parts. In the recovering colon, we observed dramatic alterations in the distal tissues, while the proximal parts remained more similar to the healthy colon. In the injured distal colon, we mapped multiple gene expression programs associated with distinct biological responses to tissue injury.

In article IV, we introduce an experimental protocol that makes the Visium method compatible with fresh frozen tissue samples with low RNA quality. The protocol was tested on human prostate cancer, lung, colon, small intestine and pediatric brain tumor tissue samples, as well as mouse brain and cartilage tissue samples. Together, these tissue samples represented a wide selection of specimens with varying composition and RNA quality. Through comparative analyses, we demonstrated that the proposed experimental protocol surpassed the standard Visium protocol in performance for samples with low to moderate RNA integrity.

Finally, in article V, we present an updated R package for Visium data analysis. This R package builds upon the work presented in article I, but offers a more versatile and efficient computational framework. The package features web-based tools for interactive data exploration, image processing methods and methods to map cell types in tissue sections. Additionally, it includes several spatially aware analysis methods that incorporate information about distances between measurements to investigate biological phenomena that exhibit spatial patterns.

Under de senaste decennierna har tillkomsten av banbrytande bioteknologiska metoder gjort det möjligt för forskare att analysera de molekylära komponenterna i flercelliga organismer med anmärkningsvärd precision. Forskningsfältet transkriptomik har bevittnat en snabb utveckling av teknologier som har utökat möjligheterna att erhålla omfattande genuttrycksprofiler från biologiska prover. Dessa genuttrycksprofiler ger avgörande insikter i biologiska processer som ligger till grund för organismers utveckling, homeostas och sjukdomsframkallande dysreglering. Moderna teknologier kan användas för att utforska prover i olika grader av precision och upplösning, och när de kombineras bidrar de till en holistisk bild av de invecklade molekylära mekanismerna som formar flercelliga organismer. Vissa av dessa molekylära mekanismer förekommer i mikroskopisk skala och styrs genom kommunikation mellan närliggande celler. Andra mekanismer är beroende av samordnade processer inom stora nätverk av celler organiserade i vävnader och organ. Celler, vävnader och organ bildar en hierarki av strukturella nivåer, och varje nivå spelar en viktig roll för att organismen ska fungera korrekt. Experimentella teknologier inom fältet transkriptomik ger omfattande data som kan användas för att utforska och karaktärisera biologiska fenomen inom och mellan dessa strukturella nivåer. Det centrala temat för denna avhandling kretsar kring användningen av experimentella teknologier och beräkningsmetoder inom biologisk forskning. Här undersöks hur dessa verktyg kan användas för att förbättra vår förståelse av flercelligt liv. Särskild uppmärksamhet riktas mot en teknologi känd som Visium, vilken haft en viktig position inom fältet de senaste åren. Forskningsartiklarna som ingår i denna avhandling visar tillämpningarna av Visium-teknologin och relaterade teknologier inom biologisk forskning. 

I artikel I beskriver vi beräkningsverktyg för bearbetning, analys och visualisering av Visium-data, sammansatt till ett paket skrivet i programmeringsspråket R. Verktygen möjliggör karaktärisering av genuttrycksprofiler i vävnadssnitt och integrering av genuttrycksdata med histologiska bilder i en interaktiv programmeringsmiljö. Denna mjukvara användes i stor utsträckning för de dataanalyser som presenteras i artiklarna II, III och IV och analyser gjorda i artiklarna listade i den utökade publikationslistan. 

I artikel II presenterar vi ett atlas för det mänskliga hjärtat under utveckling, baserat på data framställd med transkriptomiska metoder. Atlasen omfattar tre tidpunkter under den första trimestern, konstruerad med hjälp av genuttrycksdata från celler och vävnadssnitt. Integrerad analys av dessa data möjliggjorde karakterisering av genuttrycksprofiler och den cellulära sammansättningen av anatomiska domäner i hjärtat, vilket belyser de biologiska processer som ligger till grund för hjärtats morfogenes hos människor. 

Artikel III utgör en studie av genuttryckslandskapet i tjocktarmen hos möss, genererad med spatial transkriptomik. Genom att vika organet till en rulle kunde vi erhålla vävnadssnitt som täcker hela tjocktarmen, vilket möjliggjorde transkriptomisk profilering av hela organet i ett enda experiment. Vävnadssnitt togs från en frisk tjocktarm och en tjocktarm som återhämtade sig från skada inducerad med en vävnadsskadande substans (DSS-inducerad kolit). Datadriven analys av den friska tjocktarmen avslöjade en tidigare oupptäckt molekylär regionalisering från de proximala till distala delarna. I den skadade tjocktarmen fann vi dramatiska förändringar i de distala vävnaderna, medan de proximala delarna var mer jämförbara med den friska tjocktarmen. I den skadade distala tjocktarmen kartlade vi flera genuttrycksprogram associerade med distinkta biologiska svar på vävnadsskada. 

I artikel IV introducerar vi ett experimentellt protokoll som utökar tillämpningarna av Visium-metoden för att studera vävnadsprover med låg RNA-kvalitet. Protokollet testades på vävnadsprover från prostatacancer, lunga, tjocktarm, tunntarm och pediatrisk hjärntumör från människa, samt vävnadsprover från hjärna och brosk från mus. Tillsammans representerade dessa prover ett brett urval av vävnader med varierande sammansättning och RNA-kvalitet. Genom jämförande analyser visade vi att denna experimentella metod överträffade det standardiserade Visium-protokollet för prover med låg till måttlig RNA-kvalitet. 

Slutligen, i artikel V, presenterar vi en uppdaterad mjukvara (R-paket) för analys av Visium-data. Detta R-paket bygger på det arbete som presenterades i artikel I, men erbjuder mer mångsidiga och effektiva verktyg för bearbetning, analys och visualisering av data. Paketet inkluderar bland annat webbaserade verktyg för interaktiv utforskning av data, bildbehandlingsmetoder och metoder för att kartlägga celltyper i vävnadssnitt. Vidare innehåller paketet ett antal analysmetoder som inkorporerar information om avstånd mellan mätningar, vilket möjliggör undersökning av biologiska fenomen som uppvisar spatiala mönster.