Traditional optical microscopy techniques are limited in spatial resolution due to the wave nature of light. This means that neighboring objects separated by a distance smaller than about 200 nm cannot be distinguished. Super‑resolution microscopy techniques overcome this limitation by utilizing specific light-matter interactions of fluorescent labels to encode finer spatial detail into the recorded data. Regrettably, current super‑resolution approaches often increase the complexity of sample preparation as well as the energy, time, and invasiveness of the imaging scheme compared to conventional imaging techniques. This makes many of these techniques ill‑suited for imaging the dynamics of living cells. Since many biological studies rely on highly spatially resolved data containing three‑dimensional and temporally dynamic information, developing super‑resolution techniques toward the goal of acquiring such data is vital. With this work, we take several important steps in this direction by utilizing reversibly switchable fluorescence proteins (RSFPs) together with new illumination patterns that allow for a parallelized data acquisition scheme. Even low intensity illumination patterns can induce photo‑switching of the RSFPs and generate specific patterns of fluorescent emission that carry high‑resolution spatial information in all three dimensions. By using RSFPs in a parallelized acquisition scheme, temporally extended recordings can be acquired with low illumination intensities and at high speed. In addition to the imaging schemes, we present a theoretical framework for modelling the impact that RSFP properties on image formation and show how different imaging parameters affect the final image quality. We predict and explore the effect of labelling density and photobleaching on single and timelapse recordings, taking into consideration the stochasticity of labelling and fluorophore fatigue. We also ^present a new family of red‑shifted RSFPs that can be imaged without the need for near‑UV illumination, allowing even less invasive live‑cell imaging. This work aims to not only provide new tools for imaging, but also to contribute to a better understanding of the underlying concepts and to facilitate future developments of super-resolution microscopy for bio-imaging applications.

Traditionella mikroskopitekniker har, till följd av ljusets vågegenskaper, en begränsad upplösning. Detta innebär att objekt som befinner sig närmre varandra är cirka 200 nm inte kan särskiljas eftersom bilderna är suddiga. Superupplösta mikroskopitekniker kringgår denna begränsning genom att utnyttja specifika interaktioner mellan ljus och fluorescerande molekyler för att koda in mer detaljerat spatiell information in i den inhämtade datan. Dagens superupplösta tekniker innebär dock ofta en ökad komplexitet i förberedelsen av proven samt mer energikrävande, tidskrävande och invasiva avbildningsekvenser. Detta tillsammans gör många av dessa tekniker dåligt lämpade för avbildning av levande celler. Eftersom många biologiska studier bygger på högupplöst data med tredimensionell och dynamisk information är det viktigt att nya tekniker utvecklas för att inhämta sådan data. Med detta arbete tar vi flera viktiga steg mot detta mål genom att utnyttja reversibelt omställningsbara fluorescerande proteiner tillsammans nya belysningsmönster som möjliggör parallelliserad datainhämtning. Även belysningsmönster med låg intensitet kan få proteinerna att inta fluorescerande eller ickefluorescerande tillstånd och genererar emissionsmönster som förmedlar information om provets små detaljer i alla tre spatiella dimensioner.  Genom att använda omkopplingsbara proteiner i ett parallelliserat avbildningssystem så kan bildsekvenser som sträcker sig över lång tid med hög temporal upplösning skapas med endast låga ljusintensiteter. Utöver dessa nya avbildningssekvenser presenterar vi också ett teoretiskt ramverk för att modellera den påverkan som de omställningsbara proteinernas egenskaper, samt olika avbildningsparametrar, har på den slutliga bildkvaliteten. Vi förutspår och undersöker effekten av inmärkningsdensitet och fotoblekning på enstaka bilder och bildsekvenser med beaktande av den stokastisitet som kopplas till dessa fenomen. Vi presenterar också en ny familj av reversibelt omkopplingsbara proteiner som styrs med rödare våglängder och som kan avbildas helt utan ljus nära den ultravioletta delen av spektrat, vilket möjliggör ännu mindre invasiv avbildning. Detta arbete ämnar inte bara att förse med nya verktyg för avbildning, utan också bidra till en bättre förståelse för de underliggande principerna och att främja framtida utveckling av superupplösta mikroskopitekniker för avbildning inom biologiska tillämpningar.

Neurons are polarized cells that encode information in the nervous system viaelectrochemical connections named synapses. The tuning of synapticconnections is enabled by a plastic protein trafficking system which operates atthe nanoscale to finely tweak the neuronal ultrastructure. Our understanding ofthe neuronal biology has certainly benefited from the advent of live-cellcompatible fluorescence techniques able to reach the molecular level. However,the neuronal trafficking system involves molecular complexes, from organelles tosynaptic modulators, which act with varying dynamics at differentspatiotemporal scales. A single technique struggles to portrait these complexphenomena since it is hard to combine molecular resolution, speed, and lowphototoxicity. Hence, their investigation often demands, together with technicaladvancements, the combination of advanced fluorescence methods withcomplementary features. In this thesis, I explore the neuronal protein traffickingsystem at the molecular scale applying cutting-edge fluorescence microscopy andspectroscopy techniques.The relationship between the geometry and dynamics of the tubular endoplasmicnetwork and the sub-compartment size of neurons is investigated using acombination of STED and parallelized RESOLFT microscopy. In addition, thethree-dimensional dynamic interaction between tubular endoplasmic reticulumand mitochondria is described.The basal activity-driven recycling of synaptic vesicles is, for the first time,monitored via event-triggered STED, an automated method able to initiate STEDimaging upon detection of events such as calcium spikes.Insights into the post-synaptic reorganization of scaffolding and skeletal proteinsupon stimulation is gained by extending the live-cell super-resolution throughputto all the dimensions with multi-foci and 3D parallelized RESOLFT.Lastly, the molecular states of Activity-Regulated Cytoskeleton-Associatedprotein (Arc) involved in distinct aspects of neuronal protein trafficking arestudied. Our observations, obtained combining distinct advanced methods asDNA-PAINT and STARSS, support a previously unexplored Arc mechanism ofaction.

Neuroner är polariserade celler som kodar information i nervsystemet viaelektrokemiska kopplingar genom synapser. Inställningen av synaptiskaanslutningar möjliggörs av ett plastproteinhandelssystem som fungerar pånanoskala för att finjustera den neuronala ultrastrukturen. Vår förståelse av denneuronala biologin gynnades verkligen av tillkomsten av levande cell-kompatiblafluorescenstekniker som kan nå den molekylära nivån. Emellertid involverar detneuronala människohandelssystemet molekylära komplex, från organeller tillsynaptiska modulatorer, som verkar med distinkt dynamik på varierandespatiotemporala skalor. En enda teknik kämpar för att porträttera dessakomplexa fenomen eftersom det är svårt att kombinera molekylär upplösning,hastighet och mildhet. Därför kräver deras undersökning ofta, tillsammans medtekniska framsteg, kombinationen av fluorescensmetoder med komplementäraegenskaper. I avhandlingen utforskar jag det neuronala proteinhandelssystemeti molekylär skala med användning av distinkta banbrytandefluorescensmikroskopi och spektroskopitekniker. Den neuronala tubuläraendoplasmatiska nätverksgeometrin och dynamiken var relaterad tillunderavdelningens storlek genom att kombinera STED och parallelliseradRESOLFT-mikroskopi. Dessutom beskrevs den tredimensionella dynamiskainteraktionen mellan tubulärt endoplasmatiskt retikulum och mitokondrier.Den basalaktivitetsdrivna återvinningen av synaptiska vesiklar övervakades förförsta gången via händelseutlöst STED, en automatiserad metod som kan initieraSTED-avbildning vid upptäckt av händelser som kalciumspikar.Insikter i den postsynaptiska omorganiseringen av byggnadsställningar ochskelettproteiner vid stimulering erhölls och utökade genomströmningen avlevande cellers superupplösning till alla dimensioner med multifoci och 3DparallelliseradRESOLFT.Slutligen studerades de molekylära tillstånden av Activity-RegulatedCytoskeleton-Associated Protein (Arc), involverat i distinkta aspekter avneuronal proteinhandel. Våra observationer, erhållna genom att kombineradistinkta avancerade metoder som DNA-PAINT och STARSS, stödjer enbågpotential verkningsmekanism som tidigare outforskad.