Over the past few decades, the advent of pioneering biotechnological methods has allowed scientists to analyze the molecular components of multicellular organisms with remarkable precision. The field of transcriptomics has witnessed a rapid development of technologies for gene expression profiling of biological samples. These gene expression profiles offer crucial insights into biological processes that underlie organism development, homeostasis, and disease-causing dysregulation. Modern transcriptomics technologies can profile samples at various degrees of precision and resolution, and when combined, they contribute to a comprehensive understanding of the complex molecular mechanisms that shape entire organisms. Some of these molecular mechanisms occur at the microscopic scale, controlled by communication between nearby cells. Other mechanisms depend on coordinated efforts between large networks of cells organized into tissues and organs. Cells, tissues and organs represent hierarchical levels of structural organization, and each level plays a vital role in the proper functioning of the organism. Gene expression profiling technologies yield comprehensive data that can be harnessed to explore and characterize biological phenomena within and across these structural levels. The central theme of this thesis revolves around the use of experimental technologies and computational methods in the field of transcriptomics to enhance our understanding of multicellular life. Particular attention is directed at a technology known as Visium, which has held an important position in the field in recent years. The research articles included in this thesis demonstrate the applications of Visium and related technologies in biological research.

In article I, we present a computational toolbox for processing, analyzing, and visualizing Visium data, assembled into an open-source package written in the R programming language. The package facilitates the characterization of gene expression profiles in tissue sections and seamlessly integrates expression data with corresponding histological images. This computational framework was used extensively for the data analyses presented in articles II, III and IV and the articles listed in the extended list of publications.

In article II, we report one of the first spatiotemporal, transcriptomics atlases of the developing human heart. The atlas encompasses three developmental time points during the first trimester, and is constructed from gene expression data from isolated cells and intact tissue sections. Joint analysis of this data enabled characterization of the transcriptomic profiles and the cellular composition of anatomical domains within the heart, illuminating biological processes that underlie cardiac morphogenesis in humans.

Article III constitutes a study of the transcriptomic landscape of the murine colon generated using spatially resolved transcriptomics. By folding the organ into a roll, we successfully obtained tissue sections covering the entire colon, enabling organ-wide transcriptomic profiling. Sections were acquired from a healthy colon and a colon recovering from damage due to treatment with a tissue-damaging substance. Data-driven analysis of the healthy colon unveiled a previously undiscovered molecular regionalization from the proximal to distal parts. In the recovering colon, we observed dramatic alterations in the distal tissues, while the proximal parts remained more similar to the healthy colon. In the injured distal colon, we mapped multiple gene expression programs associated with distinct biological responses to tissue injury.

In article IV, we introduce an experimental protocol that makes the Visium method compatible with fresh frozen tissue samples with low RNA quality. The protocol was tested on human prostate cancer, lung, colon, small intestine and pediatric brain tumor tissue samples, as well as mouse brain and cartilage tissue samples. Together, these tissue samples represented a wide selection of specimens with varying composition and RNA quality. Through comparative analyses, we demonstrated that the proposed experimental protocol surpassed the standard Visium protocol in performance for samples with low to moderate RNA integrity.

Finally, in article V, we present an updated R package for Visium data analysis. This R package builds upon the work presented in article I, but offers a more versatile and efficient computational framework. The package features web-based tools for interactive data exploration, image processing methods and methods to map cell types in tissue sections. Additionally, it includes several spatially aware analysis methods that incorporate information about distances between measurements to investigate biological phenomena that exhibit spatial patterns.

Under de senaste decennierna har tillkomsten av banbrytande bioteknologiska metoder gjort det möjligt för forskare att analysera de molekylära komponenterna i flercelliga organismer med anmärkningsvärd precision. Forskningsfältet transkriptomik har bevittnat en snabb utveckling av teknologier som har utökat möjligheterna att erhålla omfattande genuttrycksprofiler från biologiska prover. Dessa genuttrycksprofiler ger avgörande insikter i biologiska processer som ligger till grund för organismers utveckling, homeostas och sjukdomsframkallande dysreglering. Moderna teknologier kan användas för att utforska prover i olika grader av precision och upplösning, och när de kombineras bidrar de till en holistisk bild av de invecklade molekylära mekanismerna som formar flercelliga organismer. Vissa av dessa molekylära mekanismer förekommer i mikroskopisk skala och styrs genom kommunikation mellan närliggande celler. Andra mekanismer är beroende av samordnade processer inom stora nätverk av celler organiserade i vävnader och organ. Celler, vävnader och organ bildar en hierarki av strukturella nivåer, och varje nivå spelar en viktig roll för att organismen ska fungera korrekt. Experimentella teknologier inom fältet transkriptomik ger omfattande data som kan användas för att utforska och karaktärisera biologiska fenomen inom och mellan dessa strukturella nivåer. Det centrala temat för denna avhandling kretsar kring användningen av experimentella teknologier och beräkningsmetoder inom biologisk forskning. Här undersöks hur dessa verktyg kan användas för att förbättra vår förståelse av flercelligt liv. Särskild uppmärksamhet riktas mot en teknologi känd som Visium, vilken haft en viktig position inom fältet de senaste åren. Forskningsartiklarna som ingår i denna avhandling visar tillämpningarna av Visium-teknologin och relaterade teknologier inom biologisk forskning. 

I artikel I beskriver vi beräkningsverktyg för bearbetning, analys och visualisering av Visium-data, sammansatt till ett paket skrivet i programmeringsspråket R. Verktygen möjliggör karaktärisering av genuttrycksprofiler i vävnadssnitt och integrering av genuttrycksdata med histologiska bilder i en interaktiv programmeringsmiljö. Denna mjukvara användes i stor utsträckning för de dataanalyser som presenteras i artiklarna II, III och IV och analyser gjorda i artiklarna listade i den utökade publikationslistan. 

I artikel II presenterar vi ett atlas för det mänskliga hjärtat under utveckling, baserat på data framställd med transkriptomiska metoder. Atlasen omfattar tre tidpunkter under den första trimestern, konstruerad med hjälp av genuttrycksdata från celler och vävnadssnitt. Integrerad analys av dessa data möjliggjorde karakterisering av genuttrycksprofiler och den cellulära sammansättningen av anatomiska domäner i hjärtat, vilket belyser de biologiska processer som ligger till grund för hjärtats morfogenes hos människor. 

Artikel III utgör en studie av genuttryckslandskapet i tjocktarmen hos möss, genererad med spatial transkriptomik. Genom att vika organet till en rulle kunde vi erhålla vävnadssnitt som täcker hela tjocktarmen, vilket möjliggjorde transkriptomisk profilering av hela organet i ett enda experiment. Vävnadssnitt togs från en frisk tjocktarm och en tjocktarm som återhämtade sig från skada inducerad med en vävnadsskadande substans (DSS-inducerad kolit). Datadriven analys av den friska tjocktarmen avslöjade en tidigare oupptäckt molekylär regionalisering från de proximala till distala delarna. I den skadade tjocktarmen fann vi dramatiska förändringar i de distala vävnaderna, medan de proximala delarna var mer jämförbara med den friska tjocktarmen. I den skadade distala tjocktarmen kartlade vi flera genuttrycksprogram associerade med distinkta biologiska svar på vävnadsskada. 

I artikel IV introducerar vi ett experimentellt protokoll som utökar tillämpningarna av Visium-metoden för att studera vävnadsprover med låg RNA-kvalitet. Protokollet testades på vävnadsprover från prostatacancer, lunga, tjocktarm, tunntarm och pediatrisk hjärntumör från människa, samt vävnadsprover från hjärna och brosk från mus. Tillsammans representerade dessa prover ett brett urval av vävnader med varierande sammansättning och RNA-kvalitet. Genom jämförande analyser visade vi att denna experimentella metod överträffade det standardiserade Visium-protokollet för prover med låg till måttlig RNA-kvalitet. 

Slutligen, i artikel V, presenterar vi en uppdaterad mjukvara (R-paket) för analys av Visium-data. Detta R-paket bygger på det arbete som presenterades i artikel I, men erbjuder mer mångsidiga och effektiva verktyg för bearbetning, analys och visualisering av data. Paketet inkluderar bland annat webbaserade verktyg för interaktiv utforskning av data, bildbehandlingsmetoder och metoder för att kartlägga celltyper i vävnadssnitt. Vidare innehåller paketet ett antal analysmetoder som inkorporerar information om avstånd mellan mätningar, vilket möjliggör undersökning av biologiska fenomen som uppvisar spatiala mönster.

Transcriptomics is one of the pivotal fields in molecular biology, enabling comprehensive analysis of gene expression patterns. Recent advancements in the biotechnology field have transformed the transcriptomics research, providing insights into the complexity of cellular processes in a greater detail. However, conventional transcriptomics methods such as bulk RNA sequencing or single-cell RNA sequencing rely on tissue dissociation and therefore lack spatial information, which limits our understanding of gene expression patterns within the tissue structures. The development of spatially resolved transcriptomics methods has revolutionized the study of transcriptomes, enabling analysis of gene expression patterns in the spatial context. The wide range of available transcriptomics technologies offer various levels of resolution and throughput, and combination of multiple techniques can be beneficial for studying biological systems and gain deeper understanding of their molecular processes. In this thesis, particular emphasis is given to the Visium spatial gene expression technology, which has gain widespread popularity in the research community over the recent years. 

In the article I, we expand the application of the Visium platform to fresh-frozen samples of lower RNA quality or otherwise challenging characteristics. To achieve this, we introduce specific modifications to the commercially available protocol and test its effectiveness across different tissue types of varying RNA quality, including pediatric brain tumors, human small intestine, and mouse bone and cartilage. By conducting comparative analysis, we demonstrate that the new protocol outperforms the standard Visium protocol when working with samples of moderate and lower RNA quality.

Article II introduces a novel method that enhances the resolution of the Visium gene expression method through tissue expansion. We showcase the implementation of this new protocol on two regions of mouse brain, olfactory bulb and hippocampus. We demonstrate the ability of this approach to study smaller tissue structures that were previously beyond the resolution capabilities of the Visium platform.

In the article III and IV, we demonstrate the practical application of the Visium approach and its combination with other methodologies in the field of developmental biology. We show how utilizing spatial transcriptomics methods help elucidate the spatial organization of cell types and cell states during organogenesis in the developing human spinal cord (article III) and developing lung tissue (article IV). By deploying single-cell RNA sequencing and spatial methods, we described the spatiotemporal gene expression profiles of various cell types as well as shared and unique events occurring during the spinal cord development in humans and rodents (article III). Applying this multimodal approach to lung tissue (article IV) allowed us to characterize novel cell states emerging during lung development and provided valuable insights into the structural organization of developing lungs. These studies highlight the findings and observations that can be gained by combining spatially resolved transcriptomics with other laboratory techniques to shed light on the spatial dynamics of cellular processes during organ development.

Transkriptomik är ett centralt område inom molekylärbiologi som möjliggör övergripande analys av genuttrycksmönster. De senaste framstegen inom bioteknik har revolutionerat transkriptomikforskningen vilket gett nya insikter i cellulära processers komplexitet på en mer detaljerad nivå. Konventionella transkriptomikmetoder som bulk-RNA-sekvensering eller single-cell RNA-sekvensering förlitar sig dock på dissociering av vävnad och saknar därför spatial information, vilket begränsar vår förståelse av genuttrycksmönster inom vävnaden. Utvecklingen av spatialt upplöst transkriptomik har revolutionerat studerandet av transkriptom genom att möjliggöra analys av genuttrycksmönster i sin spatiala kontext. Det breda utbudet av tillgängliga transkriptomiktekniker erbjuder olika nivåer av upplösning och kapacitet, och kombinationen av flera tekniker kan vara fördelaktig för studier av biologiska system för att uppnå en djupare förståelse av deras molekylära processer. I den här avhandlingen läggs särskild vikt på Visium-teknologin för spatialt genuttryck, som har blivit mycket populär inom forskarvärlden under de senaste åren.

I Artikel I expanderar vi tillämpningen av Visium-plattformen till färskfrusna prover med lägre RNA-kvalitet eller andra utmanande egenskaper. För att uppnå detta introducerar vi specifika modifieringar till den kommersiellt tillgängliga metoden och testar dess effektivitet på olika vävnadstyper med varierande RNA-kvalitet, inklusive barnhjärntumörer, mänsklig tunntarm och musbens- och broskvävnad. Våra jämförelse analyser visar att den nya metoden överträffar standard Visium-protokollet för prover med måttlig eller lägre RNA-kvalitet.

Artikel II introducerar en ny metod som förbättrar upplösningen av Visium-metoden genom utvidgning av vävnaden. Vi applicerar detta nya protokoll på två områden i mushjärnan, specifikt luktloben och hippocampus och demonstrerar dess förmågan att studera mindre vävnadsstrukturer som tidigare låg utanför Visium-plattformens upplösningsförmåga.

I Artikel III och IV demonstrerar vi den praktiska tillämpningen av Visium-metoden och dess kombination med andra metoder inom utvecklingsbiologi. Vi visar på hur användningen av spatiala transkriptomikmetoder hjälper till att belysa den rumsliga organisationen av celltyper och celltillstånd under organogenesen i den mänskliga ryggmärgs utvecklingen (artikel III) och i lungvävnads utvecklingen (artikel IV). Genom att använda single-cell RNA-sekvensering och spatiala metoder beskrev vi de spatiala genuttrycksmönstren hos olika celltyper samt delade och unika händelser som sker under ryggmärgsutvecklingen hos människor jämfört med gnagare (artikel III). Genom att tillämpa denna multimodala metod på lungvävnad (artikel IV) karaktäriserar vi även nya celltillstånd som uppstår under lungutvecklingen och erhåller värdefulla insikter i den strukturella organisationen av utvecklade lungor. Dessa studier framhäver de resultat och iakttagelser som kan erhållas genom att kombinera spatialt upplösta transkriptomik med andra laboratorietekniker för att klargöra den spatiala dynamiken hos cellulära processer under organs utveckling.