Engineering naturally occurring proteins enables us to customize affinity domains according to our specific needs, tailoring them to become an important tool in a wide array of applications limited merely by our creativity. One of nature’s ways to regulate protein activity is by creating a functional change through alteration of a protein’s tertiary structure upon interaction with metal ions. Inspired by this elegant solution, this thesis has focused on engineering calcium-regulated affinity proteins using two different strategies and protein scaffolds.

The first strategy revolved around designing and selecting a calcium- binding motif that can render the inherent target affinity of a naturally occurring protein domain to be turned on or off depending on whether calcium is present or not. The subject of this part of the thesis was one of the immunoglobulin-binding domains derived from Streptococcal Protein G. A library of various loops with prerequisites for attracting calcium was inserted between the IgG-binding surfaces of the domain prior to performing cell display selections aimed for rendering the inherent target interaction dependent on the presence of calcium. Successful selections resulted in a calcium-dependent version of the IgG-binding protein and its structure could be solved using NMR. A deeper investigation of the incorporated structural calcium-dependency could explain the underlying mechanisms giving rise to the functional on-and-off switch in target affinity and show how it derived from the evolutionary selection pressures applied.

The second strategy included the creation of a combinatorial library based on a calcium-dependent protein scaffold, derived from Staphylococcal Protein A, for development of small calcium-regulated affinity – CaRA –imolecules with novel target specificities. Mimicking the multifaceted usefulness of naturally occurring metalloproteins, this second part of the thesis aimed at performing phage display selection campaigns towards a diverse set of targets relevant for various applications from bioprocessing (e.g. scFv) to biological therapies (e.g. TNFa, IL-23, EGFR). When evaluating the binding properties in the presence and absence of calcium, all discovered CaRA variants display calcium-dependent binding and target affinities in the nanomolar range.

Engineering conditional binding can enhance the potential of next generation therapies in several ways. When used as calcium-dependent affinity ligands, it enables mild purification at neutral pH of therapeutic antibodies and antibody fragments that was previously limited by harsh acidic elution conditions. Reducing the risk of aggregated product by eluting at neutral pH would result in improved safety as well as the possibility to manufacture a greater repertoire of antibody formats. Furthermore, the conferred calcium- dependency of the CaRA scaffold can be used in a therapeutic approach envisioned to result in increased tissue penetration due to its small size and improved intracellular delivery by taking advantage of the existing calcium- gradient across the endosomal membrane of cells. This could lead to higher therapeutic efficacy by enabling lower doses or dosing frequency, further advancing a more patient-friendly future.

När biologi kombineras med ingenjörers strukturerade tankesätt kan naturligt förekommande proteiner förvandlas till användbara verktyg, skräddarsydda för en mängd olika applikationer som endast verkar begränsas av vår fantasi.

Naturligt förekommande proteiner har oftast en dedikerad funktion, en uppgift att utföra, och aktivitetsgraden kan styras genom förändringar i proteinets struktur via interaktion med andra småmolekyler, såsom exempelvis metalljoner. Inspirerad av naturens eleganta lösningar utforskar denna avhandling olika tillvägagångssätt för att konstruera metallreglerade proteiner vars interaktion med ett målprotein kan slås på eller stängas av genom tillgång till kalcium.

Den första strategin kretsar kring att förädla ett existerande protein som redan kan känna igen och interagera med antikroppar till att endast kunna upprätthålla den förmågan i närvaro av kalcium. Tack vare banbrytande molekylärbiologiska tekniker som möjliggjort att vi idag kan klippa och klistra i arvsmassa (DNA) så finns möjligheten att infoga och kombinera gener som uttrycker olika proteinfunktioner. I detta fall kombinerades ett protein som molekylärt kan känna igen och har affinitet för vissa antikroppar med diverse strukturella motiv som kan binda kalcium. För att lyckas utveckla ett kalciumbindande motiv som kan påverka den existerande affiniteten till antikroppar byggdes ett bibliotek med olika motiv med olika förutsättningar för att attrahera kalciumjoner och detta infogades mellan de antikroppsbindande ytorna på proteinet, i hopp om att strukturen och funktionen hos proteinet skulle kunna regleras genom inbindningen av kalcium. Biblioteket genomsöktes efter varianter som uppvisade den eftersökta förmågan, kalciumberoende interaktion med antikroppar, och viiiihittade flera varianter som uppfyllde detta. Genom att undersöka proteinstrukturen på en av dessa nya kalciumberoende antikroppsbindande varianter så kunde vi förklara de underliggande mekanismerna i strukturen som gör att proteinets funktion regleras med hjälp av kalcium.

Vår andra strategi för att konstruera kalciumberoende proteiner är mer generell och syftar till att använda ett bibliotek med proteinvarianter som redan har förmågan att binda kalcium men som kan utvecklas till att interagera med andra molekyler än antikroppar. Vår vision är att kunna utveckla kalciumreglerad affinitet för vilket målprotein som än önskas och hittills har vi utvecklat flera proteiner vars affinitet för sin specifika målmolekyl kan regleras med hjälp av kalcium.

Det finns många tillämpningar där det kan vara användbart att ha ett protein vars funktion kan regleras. En stor del av den moderna läkemedelsutvecklingen drivs av cellfabriker som producerar proteiner, ofta antikroppar, som kan känna igen och hämma cancer eller inflammation när de injiceras i patienter. Cellerna producerar dock andra molekyler som krävs för deras överlevnad samtidigt som de tillverkar antikropparna och därför krävs efterföljande reningssteg som separerar de intressanta proteinerna ifrån biprodukterna. Ett kalciumberoende protein som binder antikroppar kan därför användas för att isolera det potentiella läkemedlet ifrån biprodukterna och därefter lösgöras ifrån antikroppen igen genom borttagning av kalcium.

Proteinbaserad läkemedelsutveckling innebär även fantastiska möjligheter för kreativa terapeutiska strategier. Ett kalciumberoende biologiskt läkemedel kan styras av de naturliga skiftningar i kalciumkoncentration som återfinns i kroppen och exempelvis designas på ett finurligt sätt till att leverera en sjukdomsframkallande molekyl till kroppens egna celler för nedbrytning.ivSammanfattningsvis presenterar denna avhandling olika tillvägagångssätt för att utveckla proteiner vars funktion kan regleras genom tillgången på kalcium för diverse applikationer. Förhoppningsvis kommer dessa kunna bidra till nya tillverkningsprocesser av antikroppsbaserade läkemedel och inspirera till utveckling av framtidens proteinbaserade läkemedel.