Directed evolution using combinatorial protein libraries is a tremendously powerful technique for the generation of proteins with new or improved properties. A key aspect in such techniques is the link between individual protein variants and their corresponding genetic information. To provide this link, the most successful combinatorial protein engineering methods employ microorganisms, such as bacteriophages, bacteria or yeast for the production and display of libraries. This thesis focuses on the development and application of new directed evolution methods utilizing the bacterium Escherichia coli (E. coli), for the engineering of affinity proteins and proteases.

The first study aimed to engineer the substrate specificity of a protease from tobacco etch virus (TEV). For this purpose, a novel method was devised based on expression of intracellular protease libraries, and employed a reporter fusion protein consisting of amyloid β peptide fused to the N-terminus of enhanced green fluorescent protein (EGFP). Variants were screened for proteolytic activity on co-expressed target substrate by means of fluorescence-activated cell sorting (FACS). After three rounds of FACS, a set of TEV protease variants were enriched that exhibited improved proteolytic activity on the novel substrate.

Studies two to four describe the development of an E. coli surface expression system that was explored for directed evolution applications. The method is based on display of recombinant proteins on the outer membrane via fusion to a bacterial autotransporter, adhesin involved in diffuse adherence I (AIDA-I). The second study focused on the optimization of the surface display system and its application to directed evolution. In this effort, several affinity protein classes were evaluated for surface display via AIDA-I in a panel of E. coli strains. Results showed that smaller and less complicated affibody molecules were displayed at high levels, while more complex proteins, such as antibody fragments, varied in their performance and functioned best in certain engineered strains. A mock affibody library was used to develop a high-throughput magnetic-assisted cell sorting (MACS) protocol for enrichment of binders from very large libraries.

In the third and fourth study, the new E. coli display method combined with the MACS protocol was evaluated for generation of new affibody molecules.

In the third study, a large naïve affibody library (>1.5×10¹¹ members) was constructed, displayed on E. coli and characterized. The performance of the method and library was evaluated by selection of binders against two cancer-associated targets, tumor-associated calcium signal transducer 2 (TROP-2) and lymphocyte-activation gene 3 (LAG-3). MACS and FACS were performed, with flow cytometry assessment between rounds to monitor enrichment. Both selections produced high affinity binders to their respective targets.

In the fourth study, a maturation library was constructed for improving the properties of an affibody molecule toward the renal cell carcinoma biomarker carbonic anhydrase IX (CAIX). Selections included stringent off-rate procedures and yielded variants with improved affinities and folding stability compared to previously reported binders.

In summary, the work in this thesis demonstrate the potential of E. coli-based directed evolution methods for selection of new proteins with altered or improved properties.

Riktad evolution med hjälp av kombinatoriska proteinbibliotek är en oerhört kraftfull teknik för att ta fram proteiner med nya eller förbättrade egenskaper. En viktig del i sådana tekniker är att det finns en länk mellan individuella proteinvarianter och deras motsvarande genetiska information. För att tillhandahålla denna länk nyttjar de mest framgångsrika metoderna mikroorganismer, såsom bakteriofager, bakterier eller jästceller för produktionen och uttryck av proteinbibliotek. Denna avhandling fokuserar på utveckling och tillämpning av nya riktade evolutionsmetoder som använder bakterien Escherichia coli (E. coli) för selektion av nya affinitetsproteiner och proteaser.

Den första studien syftade till att förändra substratspecificiteten för ett proteas från tobacco etch virus (TEV). För detta ändamål utvecklades en metod baserad på expression av intracellulära proteasbibliotek, och använde ett reporterfusionsprotein bestående av amyloid β-peptid fuserad till N-terminalen av förstärkt grönt fluorescerande protein (EGFP). Varianter screenades för proteolytisk aktivitet på samuttryckt målsubstrat med hjälp av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Efter tre rundor av FACS selekterades ett antal varianter av TEV-proteas som uppvisade förbättrad proteolytisk aktivitet på det nya substratet.

Studierna två till fyra beskriver utvecklingen av en annan E. coli-metod som utforskades för riktad evolution av affinitetsproteiner. Metoden är baserad på expression av rekombinanta proteiner på det yttre membranet av E. coli via fusion till en bakteriell autotransporter, adhesin involved in diffuse adherence I (AIDA-I). Den andra studien fokuserade på optimering av metoden och dess tillämpning inom riktad evolution. I studien utvärderades flera olika affinitetsproteiner för expression via AIDA-I i en panel av E. coli-stammar. Resultaten visade att relativt små affibodymolekyler uttrycktes i höga nivåer, medan större och mer komplexa proteiner, såsom antikroppsfragment, varierade i uttryck och bara fungerade i vissa modifierade stammar. I studien utvecklades även ett protokoll för magnet-assisterad cellsortering (MACS) med syftet att möjliggöra selektion av bindare från mycket stora bibliotek.

I den tredje och fjärde studien utvärderades den nya E. coli-metoden i kombination med MACS-protokollet för selektion av nya affibodymolekyler.

I den tredje studien konstruerades ett stort naivt affibody-bibliotek (>1,5×10¹¹ varianter). Potentialen hos metoden och det nya biblioteket utvärderades genom selektion av bindare mot två cancer-associerade receptorer, tumor-associated calcium signal transducer 2 (TROP-2) och lymphocyte-activation gene 3 (LAG-3). MACS och FACS användes i selektionsprocessen, och kombinerades med flödescytometrisk analys av biblioteket mellan rundorna, för att övervaka selektionen. Båda selektionerna resulterade i nya bindare med relativt hög affinitet till sina respektive receptorer.

I den fjärde studien konstruerades ett riktat bibliotek med syftet att förbättra egenskaperna hos en affibodymolekyl mot carbonic anhydrase IX (CAIX). Selektionen inkluderade stringenta förfaranden för att anrika varianter med långsam dissociation.  Analys efter FACS visade på varianter med förbättrad affinitet och stabilitet jämfört med tidigare rapporterade bindare.

Sammanfattningsvis visar arbetet i denna avhandling potentialen hos E. coli-baserade metoder för selektion av nya proteiner med förändrade eller förbättrade egenskaper.