Protein therapeutics hold great potential in cancer treatment as they combine specificity with effective delivery to tumor sites, but traditional antibodies face limitations related to size, production cost, and stability. As an alternative, smaller protein scaffolds present a promising approach, offering reduced costs due to production in bacterial hosts, greater stability, and versatile engineering potential for diverse functionalities.

This thesis aims to contribute to the field of engineered scaffold proteins, optimizing the discovery workflow, introducing a new conditional binding scaffold, and evaluating its applicability as protein-drug conjugates for targeted cancer therapies.

The first part of this thesis aims to streamline the discovery pipeline for protein scaffolds. Study I presents an optimized high-throughput phage display system incorporating automated selection and sequencing techniques to discover protein binders efficiently, as demonstrated with the albumin binding domain-derived affinity protein (ADAPT) and Calcium-regulated affinity (CaRA) libraries. This semi-automated system reduces hands-on time and increases robustness, making the discovery process more accessible for labs without high-cost equipment. Results show the possibility of generating high-affinity binders with broad applications in diagnostics and therapeutics. Following the foundation laid by the workflow optimization, Study II introduces the CaRA library more deeply. The library is engineered to provide calcium-dependent and pH-dependent binding capabilities. The library’s design enables conditional interactions, where calcium levels modulate binding. This feature is particularly beneficial for therapeutic applications requiring precise targeting and controlled binding release. The CaRA scaffold demonstrated stability, nanomolar affinities, and calcium-dependent binding across diverse targets, with potential in both therapeutic and biotechnological settings. Study III introduces an accelerated maturation process for conditional binders to further enhance the therapeutic potential of small scaffold proteins. Utilizing deep sequencing data from initial selections with the CaRA library and E. coli display screening, a high-affinity binder for HER3 with pH-dependent binding, CaRA_HER3, was developed. This characteristic allows for rapid release in acidic environments, mimicking endosomal conditions, which could be advantageous for intracellular drug delivery. The final paper, Study IV, focuses on applying CaRA binders in developing protein-drug conjugates for targeted cancer treatment. Specifically, a CaRA-based EGFR binder (CaRA_EGFR) was engineered to bind EGFR conditionally, depending on calcium levels. This calciumregulated binding allows the protein to dissociate in the low-calcium environment of endosomes, potentially enhancing cytotoxic drug delivery directly to tumor cells. Confocal microscopy confirmed that the CaRA_EGFR binder effectively internalizes and trafficks to lysosomes, achieving targeted cytotoxicity in EGFR-expressing cells. This approach highlights the value of conditional affinity in challenges related to the biological fate of receptors, paving the way for more effective, receptor-specific drug delivery systems. This thesis advances protein engineering for small scaffold therapeutics through new discovery workflows and calcium- and pH-dependent binding mechanisms. By advancing new ways to engineer these scaffolds, the findings contribute to developing safer, more effective proteinbased therapies for cancer treatment.

Proteinbaserade läkemedel har stor potential inom cancerbehandling eftersom de kombinerar specificitet med effektiv leverans till tumörområden. Traditionella antikroppar har dock begränsningar kopplade till storlek, produktionskostnad och stabilitet. Som ett alternativ erbjuder mindre proteinscaffolds en lovande metod, med lägre kostnader tack vare produktion i bakterieceller, högre stabilitet och mångsidig möjlighet till anpassning för olika funktioner. 

Denna avhandling syftar till att bidra till området för konstruerade proteinscaffolds genom att optimera upptäcktsprocessen, introducera ett nytt scaffold med villkorlig bindning och utvärdera dess användbarhet som protein-läkemedelskonjugat för riktad cancerbehandling. 

Den första delen av denna avhandling fokuserar på att effektivisera selektionsprocessen för proteinscaffolds. Studie I presenterar ett optimerat high-throughput-fagdisplaysystem som inkluderar automatiserade selektions- och sekvenseringstekniker för att effektivt identifiera proteinerabindare, som exemplifieras med bibliotek av albuminbindande domäner (ADAPT) och kalciumreglerade affinitetsproteiner (CaRA). Detta halvautomatiserade system minskar den manuella arbetsinsatsen och ökar robustheten, vilket gör selektiopnsprocessen mer tillgänglig för laboratorier utan högkostnadsutrustning. Resultaten visar möjligheten att generera högaffinitetsbindare med breda användningsområden inom diagnostik och terapi. Efter optimering av arbetsflödet introducerar Studie II CaRA-biblioteket mer ingående. Biblioteket är designat för att ge kalcium- och pH-beroende bindningsegenskaper, där kalciumnivåerna modulerar bindningen. Denna egenskap är särskilt fördelaktig för terapeutiska applikationer som kräver exakt målstyrning och kontrollerad dissociation. CaRA-scaffoldet uppvisade stabilitet, nanomolära affiniteter och kalciumberoende bindning till olika måll, med potential både inom terapi och bioteknologiska applikationer. Studie III introducerar en accelererad affinitetsmatureringsprocess för villkorliga bindare för att ytterligare förbättra de terapeutiska möjligheterna för små proteinscaffolds. Med hjälp av djupsekvenseringsdata från initiala selektioner med CaRA-biblioteket och E. coli display-screening utvecklades en högaffinitetsbindare för HER3 med pH-beroende bindning, CaRA_HER3. Denna egenskap möjliggör snabb frisättning i sura miljöer, som efterliknar endosomala förhållanden, vilket kan vara fördelaktigt för intracellulär läkemedelsleverans. 

Den sista studien, Studie IV, fokuserar på tillämpningen av CaRA-bindare i utvecklingen av protein-läkemedelskonjugat för riktad cancerbehandling. Specifikt utvecklades en CaRA-baserad EGFR-bindare (CaRA_EGFR) för att binda EGFR villkorligt beroende på kalciumnivåer. Denna kalciumreglerade bindning möjliggör att proteinet dissocierar i den låga kalciumhalten i endosomer, vilket potentiellt ökar cytotoxisk läkemedelsleverans direkt till tumörceller. Konfokalmikroskopi bekräftade att CaRA_EGFR-bindaren effektivt internaliseras  och transporteras till lysosomer, vilket uppnår riktad cytotoxicitet i EGFR-uttryckande celler. Detta tillvägagångssätt understryker värdet av villkorlig affinitet i utmaningar kopplade till receptorernas biologiska öde, och banar väg för effektivare, receptor-specifika läkemedelsleveranssystem. Denna avhandling främjar proteiningenjörskonst för små scaffold-baserade terapeutiska proteiner genom nya upptäcktsarbetsflöden och kalcium- och pH-beroende bindningsmekanismer. Genom att utveckla nya s.tt att konstruera dessa scaffolds bidrar resultaten till säkrare och effektivare proteinbaserade terapier för cancerbehandling.