Sepsis is a life-threatening condition with high mortality, claiming over 13 million lives annually. In patients with septic shock, each hour of delayed treatment increases the risk of death by 8%. Current diagnostic methods rely heavily on blood culture, a time-consuming process involving multiple culture steps that can take several days, delaying targeted antibiotic therapy. This underscores the urgent need for faster, culture-free diagnostic approaches.

In this work, we developed methods to detect bacteria directly from blood at low, clinically relevant concentrations ( 10 CFU/mL), enabling the potential to bypass the traditional culture process entirely. We further established technologies for direct bacterial identification and antimicrobial susceptibility testing (AST) from blood, bypassing subculture or solid culture steps, thereby facilitating targeted antibiotic therapy.

For detection at clinically relevant concentrations, we combined a centrifugation-based method for efficient bacterial isolation and concentration from blood with microfluidic trapping and automated bacterial detection using deep learning applied to microscopy images. We also designed two novel centrifugal devices to automate the above sample preparation in a single step: (1) a One-step device and (2) an inclined filter device. Both are fully automated, plug-and-play, centrifuge-only systems that isolate and concentrate bacteria while selectively lysing blood cells—without manual intervention and using only standard laboratory centrifuges. The One-step device employs trapped air to control fluid movement during centrifugation, integrating seamlessly into clinical workflows and supporting three key applications: (a) direct subculturing from low bacterial concentrations, eliminating the need for initial blood culture; (b) species identification via matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS); and (c) microfluidic single-cell detection from moderate bacterial loads, along with in-device colorimetric AST. The inclined filter device uses size-based filtration during centrifugation to isolate and concentrate bacteria, lyse blood cells, and enable subculture-based detection.

We further demonstrated AST from positive blood cultures using the One-step device in combination with an impedance-based cytometer, delivering results within 2 hours. Additionally, we adapted the inclined filter device for stool sample preparation, enabling bacterial detection using Optical DNA Mapping and demonstrating the platform’s versatility. 

Together, these technologies provide a rapid, comprehensive, and automated solution for pathogen detection and antibiotic profiling, laying the foundation for same-shift, culture-free sepsis diagnostics.

Sepsis är ett livshotande tillstånd med hög dödlighet som orsakar över 13 miljoner dödsfall årligen. Hos patienter med septisk chock ökar risken för dödlig utgång med 8 % varje timme som behandlingen fördröjs. Nuvarande diagnostiska metoder är starkt beroende av blododling – en tidskrävande process som innefattar flera odlingssteg och kan ta flera dagar, vilket fördröjer riktad antibiotikabehandling. Detta understryker det akuta behovet av snabbare, odlingsfria diagnostiska metoder.

I detta arbete har vi utvecklat metoder för att direkt detektera bakterier i blod vid låga, kliniskt relevanta koncentrationer ( 10 CFU/mL), vilket möjliggör att helt kringgå den traditionella odlingsprocessen. Vi har dessutom utvecklat teknologier för direkt bakteriell identifiering och resistensbestämning (AST) från blod, utan behov av subkultivering eller fasta odlingssteg, vilket underlättar riktad antibiotikabehandling.

För detektion vid kliniskt relevanta koncentrationer kombinerade vi en centrifugeringsbaserad metod för effektiv isolering och koncentrering av bakterier från blod med mikrofluidisk infångning och automatiserad bakteriedetektering med hjälp av djupinlärning applicerad på mikroskopibilder. Vi utvecklade även två nya centrifu genheter för att automatisera ovanstående provberedning i ett enda steg: (1) en One-step-enhet och (2) en lutande filterenhet. Båda är fullt automatiserade, plug-and-play-system som enbart använder centrifugering och som isolerar och koncentrerar bakterier samtidigt som blodceller selektivt lyseras – helt utan manuella moment och med endast standard-laboratoriecentrifuger. One-step-enheten använder luft instängd i enheten för att styra vätskeflödet under centrifugering och kan sömlöst integreras i kliniska arbetsflöden. Enheten har tre huvudsakliga tillämpningar: (a) direkt subkultur från låga bakteriekoncentrationer, vilket eliminerar behovet av initial blododling; (b) artidentifiering via matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight masspektrometri (MALDI-TOF-MS); och (c) mikrofluidisk detektion av enskilda celler vid måttliga bakterielaster, samt färgmetrisk AST i enheten. Den lutande filterenheten använder storleksbaserad filtrering under centrifugering för att isolera och koncentrera bakterier, lysera blodceller och möjliggöra subkultur-baserad detektion.

Vi har även demonstrerat AST från positiva blododlingar med hjälp av One-step-enheten i kombination med en impedansbaserad cytometer, vilket ger resultat inom 2 timmar. Dessutom anpassade vi den lutande filterenheten för provberedning av avföringsprover, vilket möjliggjorde bakteriedetektering med Optical DNA Mapping och visade plattformens mångsidighet.

Tillsammans skapar dessa teknologier en snabb, heltäckande och automatiserad lösning för patogendetektion och antibiotikaprofilering, och lägger grunden för odlingsfri sepsisdiagnostik.

Sepsis is a life-threatening condition affecting an estimated 49 million people annually and causing approximately 20% of the deaths worldwide. Survival in septic shock decreases by about 8% per hour of delayed or inappropriate treatment, making rapid diagnosis critical. Consequently, patient outcomes strongly depend on the rapid initiation of appropriate antimicrobial therapy, making sepsis diagnosis a fight against time. However, current blood culture-based workflows typically require several days to deliver actionable results, largely due to the extremely low bacterial concentrations in blood (1-100 CFU/mL) that necessitate time-consuming culture steps. There is therefore a pressing need for diagnostic protocols capable of rapidly isolating and characterizing bacteria directly from blood.

In this work, we address a key limitation in current diagnostic pipelines by developing and evaluating culture-free approaches for the rapid isolation, detection, species identification, and antimicrobial susceptibility testing (AST) of bacteria directly from blood, starting at clinically relevant concentrations. Two centrifugation-based sample preparation strategies were developed: one compatible with samples drawn into blood culture bottles and one designed for whole blood. Using the first approach, we demonstrated the isolation and identification of five common sepsis-causing bacteria within 12 hours. This approach relies solely on standard laboratory equipment, which facilitates direct translation to clinical laboratories. The whole-blood approach combines centrifugation and selective blood cell lysis with microfluidic trapping and deep learning-based automated detection, and enables culture-free detection of bacteria from blood within 2 h. Building on this foundation, the workflow was further extended to integrate real-time automated detection, single-cell phenotypic AST, and species identification by fluorescence in situ hybridization (FISH), directly from uncultured blood in under 7 h. 

The sample preparation steps of these protocols rely heavily on manual processing. Therefore, subsequent work focused on the development of a one-step centrifuge device that automates bacterial isolation and up-concentration while maintaining compatibility with downstream processes, such as subculturing, mass spectrometry-based identification, and microfluidic single-cell analysis. All approaches were evaluated using healthy human blood samples spiked with common sepsis-causing bacteria, and serve as proof-of-concept of rapid, culture-free bacterial characterization directly from blood.

Together, the results presented in this thesis demonstrate the potential of combining centrifugation-based sample preparation, microfluidics, and automated image analysis to substantially shorten diagnostic turnaround times for sepsis and bloodstream infections. Although further validation with clinical samples and increased automation are required, this work provides experimental and methodological advances toward faster sepsis diagnostics.

Sepsis är ett livshotande tillstånd som drabbar uppskattningsvis 49 miljoner människor årligen och står för ungefär 20% av alla dödsfall världen över. Överlevnad i septisk chock minskar med cirka 8% för varje timme som behandling fördröjs eller hanteras fel, varför en snabb diagnos är kritisk. Patientens utfall är därför strängt beroende av en snabb initiering av en korrekt behandling, vilket gör sepsisdiagnostik till en kamp mot klockan. Nuvarande arbetsflöden med blododling kräver dock vanligtvis flera dagar innan man får resultat som går att agera på, till stor del beror detta på extremt låga koncentrationer av bakterier i blodprover (1-100 CFU/ml) som kräver tidsödande odlingssteg. Det finns därför ett tryckande behov av diagnostiska protokoll som klarar att snabbt isolera och identifiera bakterier direkt från blod.

I det här arbetet addresserar vi centrala begränsningar i nuvarande diagnostiska flöden genom att utveckla och utvärdera odlingsfria metoder för snabb isolering, detektion och artidentifiering, samt antimikrobiell susceptibilitetstestning (AST) av bakterier direkt från blod, testad vid kliniskt relevanta koncentrationer. Två centrifug-baserade metoder för blodprovsberedning utvecklades: den ena kompatibel med prover som är tagna i blododlingsflaskor och den andra utvecklad för helblod. Genom den första metoden demonstrerar vi isolering och identifiering av fem vanliga bakterier som orsakar sepsis inom 12 timmar. Denna metod utnyttjar enbart standardiserad labbutrustning vilket möjliggör direkt translation hos kliniska laboratorier. Metoden för helblod kombinerar centrifugering och selektiv lysering av blod med mikrofluidiska fällor och deep learning baserad automatisk detektion, och möjliggör odlingsfri detektion av bakterier i blod inom 2 timmar. Med detta som bas vidareutvecklades arbetsflödet till att också inkludera automatisk realtidsdetektion, singel-cell fenotyp AST och artidentifiering genom fluorescens in situ hybridisering (FISH), direkt från blod på under 7 timmar. 

Provberedningsstegen i dessa protokoll är väldigt beroende av manuella processer. Således fokuserade efterföljande arbete på utvecklingen av en device för enstegs-centrifugering som automatiserar isolering av bakterier och uppkoncentrering och som samtidigt bibehåller kompatibilitet med processer nedströms, såsom subodlingar, mass-spektrometri-baserad identifikation, samt mikrofluidisk singelcells-analys. Alla metoder utvärderades med hjälp av friska humana blodprover som spikats med vanliga sepsisorsakande bakterier och tjänar som ett proof-of-concept för snabb, odlingsfri bakteriell karakterisering direkt från blod. 

Tillsammans demonstrerar resultaten i denna avhandling potentialen i att kombinera centrifugeringsbaserad provberedning, mikrofluidik och automatiserad bildanalys för att avsevärt förkorta diagnostiska svarstider för sepsis och infektioner i blodbanan. Även om vidare arbete med validering med kliniska prover och ökad automatisering krävs, bidrar detta arbete med experimentella och metodologiska framsteg mot snabbare sepsisdiagnostik.