Membrane proteins constitute 27% of the human proteome and play important roles in cellular processes. Dysfunction of membrane proteins causes and contributes to diverse diseases. The study of the structure and function of membrane proteins will help us to a deeply understand them. Cryo-electron microscopy (cryoEM) single-particle analysis (SPA) can provide us not only with high-resolution structures of membrane proteins but also give us the possibility to study protein’s dynamics and heterogeneous complexes they form. In this thesis, we applied SPA together with electrophysiology, surface plasmon resonance (SPR) and Microscale thermophoresis (MST) to investigate the structural and functional properties of several membrane proteins and protein complexes. 

In Paper I, we studied Pannexin 1 (PANX1), an ATP release channel involved in neurological disorders and inflammation. Electrophysiology and mass spectrometry identified Y308 as a key phosphorylation site. CryoEM structures revealed that phosphorylated PANX1 and the PANX1 R75A mutant possess conformational flexibility in the transmembrane domain. Our data show that PANX1 transits between a narrow and a wide state. This transition causes the N-terminal region to be ordered (wide) or disordered (narrow). The phosphomimetic Y308E mutant only shows a wide conformation with an ordered N-terminus. Electrophysiology shows this mutation converts PANX1 into a constitutively open channel. This suggests Y308 is a phosphorylation site that locks PANX1 into the wide conformation, enabling ATP release. 

Paper II presents a modified workflow for identifying and determining the structures of membrane proteins in a heterogeneous sample; without prior knowledge of the protein sequence or a model. We used a conventional suing SPA workflow to obtain cryoEM maps. These maps were modelled unsupervised with ModelAngelo and a HMMER search was done to obtain sequence information. Our data allowed us to generate three different maps from a heterogenous sample. We were able to identify each protein only based on the maps. The results were supported by mass spectrometry. The three E. coli membrane proteins were cytochrome bo3 oxidase (2.72 Å), AcrB (3.27 Å), and a previously uncharacterized E. coli ArnC protein (2.72 Å). Another important finding of this study is that MSP2N2 nanodiscs adapt their assembly around different proteins, implying that scaffold architecture depends on protein interactions. 

In Paper III, we examined SMCT1 interactions with PDZK1. SMCT1 is an important membrane protein that transports monocarboxylate substrates like butyrate, lactate or niacin. It was thought that PDZK1 is an important regulator that influences the transport rate of SMCT1. We tested the affinity for SMCT1 with various assays. Our pull-down assay, SPR, and MST assays revealed only weak binding, suggesting the interaction is likely physiologically irrelevant except under conditions of local PDZK1 enrichment. 

Overall, this work demonstrates the power of SPA for resolving dynamic membrane proteins, providing structural and functional insights, and establishing workflows for studying unknown or heterogeneous protein complexes. 

Membranproteiner utgör 27% av det humana proteomet och spelar viktiga roller i cellulära processer. Dysfunktion hos membranproteiner orsakar och bidrar till olika sjukdomar. Studiet av membranproteiners struktur och funktion kommer att hjälpa oss att förstå dem på en djupare nivå. Kryoelektronmikroskopi (cryoEM) med singelpartikelanalys (SPA) kan inte bara ge oss högupplösta strukturer av membranproteiner utan även möjliggör studier av proteindynamik och de heterogena komplex de bildar. I denna avhandling tillämpade vi SPA tillsammans med elektrofysiologi, ytplasmonresonans (SPR) och mikroskalig termofores (MST) för att undersöka de strukturella och funktionella egenskaperna hos flera membranproteiner och proteinkomplex. 

I Artikel I studerade vi Pannexin 1 (PANX1), en kanal för ATP- frisättning som är inblandad i neurologiska sjukdomar och inflammation. Elektrofysiologi och masspektrometri identifierade aminosyran Y308 som en viktig fosforyleringsplats. CryoEM- strukturer avslöjade att fosforylerad PANX1 och PANX1 R75A- mutanter har konformell flexibilitet i transmembrandomänen. Våra data visar att PANX1 växlar mellan ett smalt och ett brett tillstånd. Denna övergång gör att N-terminalregionen antingen blir ordnad (bred) eller oordnad (smal). En fosformimetisk Y308E-mutant visar enbart en bred konformation med en ordnad N-terminus. Elektrofysiologi visar att denna mutation omvandlar PANX1 till en konstitutivt öppen kanal. Detta tyder på att Y308 är en fosforyleringsplats som låser PANX1 i den breda konformationen och möjliggör ATP-frisättning. 

Artikel II presenterar ett modifierat arbetsflöde för att identifiera och bestämma strukturerna av membranproteiner i ett heterogent prov, utan förkunskaper om proteinsekvensen eller en modell. Vi använde ett konventionellt SPA-arbetsflöde för att erhålla cryoEM-kartor. Dessa kartor modellerades oövervakat med ModelAngelo och en HMMER-sökning gjordes för att få sekvensinformation. Våra data gjorde det möjligt för oss att generera tre olika kartor från ett heterogent prov. Vi kunde identifiera varje protein enbart baserat på kartorna. Resultaten stöddes av masspektrometri. Bland de många proteiner som identifierades fanns de tre E. coli-membranproteinerna cytochrom bo3 oxidas (2.72 Å), AcrB (3.27 Å), och ett tidigare okarakteriserat E. coli ArnC-protein (2.72 Å). En annan viktig upptäckt i denna studie är att MSP2N2-nanodiskar anpassar sin sammansättning runt olika proteiner, vilket antyder att ställningsarkitekturen beror på proteininteraktioner. 

I Artikel III undersökte vi SMCT1-interaktioner med PDZK1. SMCT1 är ett viktigt membranprotein som transporterar monokarboxylat-substrat som butyrat, laktat eller niacin. PDZK1 har ansetts vara en viktig regulator som påverkar transporttakten hos SMCT1. Vi testade affiniteten för SMCT1 med olika assay. Våra pulldown-, SPR- och MST-assays tyder dock på att bindningen är mycket svag och sannolikt fysiologiskt irrelevant utom under förhållanden med lokal PDZK1-anrikning. 

Sammanfattningsvis demonstrerar detta arbete kraften i SPA för att lösa dynamiska membranproteiner, ge strukturella och funktionella insikter, och etablera arbetsflöden för att studera okända eller heterogena proteinkomplex. 

Translated by deepseek