Membrane proteins are proteins that are embedded in the lipid bilayers oforganisms. Roughly a fourth of all human proteins are estimated to bemembrane proteins and about 60 % of human-approved medications targetmembrane proteins. The correct function of membrane proteins is essential toall organisms.

This thesis is made up of two parts. First, the biochemistry and function ofdolichol phosphate mannose synthases (DPMS) are investigated. Theseenzymes are responsible for the transfer of mannose from a nucleotide sugardonor to the acceptor lipid dolichol phosphate, forming dolichol phosphatemannose (Dol-P-Man). In eukaryotes and archaea, Dol-P-Man is the keymannose donor for mannosylation reactions inside the endoplasmic reticulum(ER) lumen or on the extracellular leaflet of cell membrane, respectively. Asthe synthesis of Dol-P-Man is known to take place on the cytoplasmic side ofthe ER membrane in eukaryotes or the cell membrane in archaea, the questionremains how Dol-P-Man is transported onto the other side of the membraneto serve as a mannose donor. This thesis presents a hypothesis in which theDPMS itself is responsible for the flipping of its own product. The hypothesisis supported by crystallographic data that shows Dol-P-Man bound to a DPMSin a “flipped” orientation that could enable the transport to the other side ofthe membrane. This thesis also covers the recombinant expression,purification, and in vitro characterization of DPMS from the zebra fish Daniorerio. This DPMS is similar to the human enzyme and can therefore yieldmechanistic details behind DPMS-related diseases.

The second part covers the development of scattering-type scanning near-fieldoptical microscopy (s-SNOM) to study proteins in solution. The method iscapable of collecting images and infrared spectra from samples at nanometerscalelateral resolution. The method is not readily applicable for the study ofobjects in solution, but this limitation can be circumvented by the use of aliquid cell. The liquid cell is first used to probe the stretching vibrations ofwater in nanoscale and the method is then further developed and is applied tocollect images and spectra from purple membranes, a model membranecomprising tightly packed bacteriorhodopsin molecules and associated lipids.

Membranproteiner är proteiner som är inbäddade i organismers cell- ellerorganellmembran. Ungefär en fjärdedel av alla mänskliga proteineruppskattas vara membranproteiner, och cirka 60 % av alla läkemedel riktar sigmot membranproteiner. Korrekt fungerande membranproteiner är docklivsavgörande för alla levande organismer.

Denna avhandling består av två delar. Först undersöksdolikolfosfatmannossyntaser (DPMS) med avseende på biokemi och funktion.Dessa enzymer ansvarar för överföringen av mannos från ennukleotidsockerdonator till acceptorlipiden dolikolfosfat varviddolikolfosfatmannos (Dol-P-Man) bildas. I eukaryoter och arkéer är Dol-PManden viktigaste mannosdonatorn för mannosyleringsreaktioner i lumen avdet endoplasmatiska retiklet (ER), samt på den extracellulära sidan avcellmembranet. Man vet att syntes av Dol-P-Man sker på den cytoplasmatiskasidan av ER-membranet, motsvarande det yttre cellmembranet hos arkéer,men frågan kvarstår gällande hur Dol-P-Man transporteras till den andrasidan där den kan fungera som mannosdonator. Avhandlingen presenterar enhypotes där DPMS självt ansvarar för transport av den egna produkten.Hypotesen stöds av kristallografiskt data där Dol-P-Man observeras bundet tillDPMS i ”omvänd orientering” (flipped) som skulle kunna möjliggöra transporttill andra sidan av membranet. Avhandling omfattar även framgångsrikproduktion, rening och funktionell karakterisering av eukaryot DPMS frånmodellorganismen Danio rerio (zebrafisk). Denna typ av DPMS liknar detmänskliga enzymet och kan därför bidra med ökad förstålse för mekanistiskadetaljer bakom DPMS-relaterade sjukdomar.

Den andra delen av avhandlingen berör utveckling av spridningsbaseradnärfältsoptisk mikroskopi (s-SNOM) för att studera proteiner i lösning.Metoden kan generera bilder och infraröda spektra från prover till en lateralupplösning i nanometerområdet. Att använde s-SNOM för studier av objekt ilösning är inte möjligt med ett normalt provsteg men denna begränsning kankringgås med hjälp av en vätskeprovcell. Vätskeprovcellen används först föratt undersöka vattnets vibrerande töjning, och därefter utvecklas metodenvidare för datainsamling på modellmembran bestående av tätt packadebakteriorhodopsinmolekyler och tillhörande lipider (purple membranes).