FN-silk is a recombinant functionalized silk protein shown to self-assemble into elastic fibrillar 3D matrices that favor in vivo-like cell-ECM interactions. This thesis aims to expand on the current understanding of FN-silk protein as a biomaterial for constructing such physiologically relevant ECM mimics, both of interstitial fibers and basement membrane, for tissue engineering applications. This is examined both in terms of optimizing existing and developing new methods for constructing FN-silk matrices, as well as utilizing them as scaffolds to develop in vitro models of barrier tissues.

Specifically, Paper I describes an optimized, and Paper II a newly developed, method to prepare FN-silk basement membrane mimics. Moreover, a new way of preparing FN-silk 3D networks is described (Paper III) and proposed as an ECM mimic for in vitro (Paper III) and in vivo applications (Paper IV). Both the FN-silk membrane and 3D network are used to construct in vitro skin tissue models presented in Paper III, and the FN-silk membrane alone is used to support an alveolar-capillary in vitro model (Paper V). Lastly, Paper IV describes the use of the 3D network as a dermal replacement scaffold in an in vivo porcine wound healing model.

Paper I established the parameters of preparing FN-silk membranes supported by custom-designed inserts in order to yield a reproducible membrane-insert culture system that could be seeded with cells bilaterally and further used for applications described in Papers III and V.

Paper II explored a different method of forming the FN-silk membrane, this time around hydrogels. Functionalizing hydrogels with FN-silk increased the native tissue mimicry not only by modeling the basement membrane but also by addressing key hydrogel shortcomings such as poor cell adhesion and inadequate mechanical properties as well as unfavorable cell-mediated hydrogel contraction.

Paper III presented and characterized FN-silk-based skin tissue 3D models. Primary human cells were cultured on FN-silk matrices, yielding standalone dermal and epidermal models as well as a bilayered dermal-epidermal one. The models feature dermal ECM production and formation of microvascular-like structures, as well as in vivo-like epidermal stratification and cornification.

Paper IV extended the favorable FN-silk-skin cell interactions in vivo, in a porcine wound healing model. The FN-silk 3D network was compared with a commercial dermal replacement scaffold, achieving a faster re-epithelialization rate and better mechanical properties of the treated wounds.

Lastly, Paper V compared the FN-silk membrane with a commercial synthetic one in the context of supporting an in vitro alveolar-capillary model. The FN-silk-based models attained high tissue mimicry in both morphological and functional characteristics, contrary to the commercial controls.  Notably, in Paper V an in vitro model of alveologenesis was established for the very first time. This was achieved on FN-silk-supported cultures.

Taken together, the work conducted in this thesis builds on the current knowledge of the potential of FN-silk as a biomaterial for in vitro and in vivo applications. It demonstrates that the chemically defined FN-silk-based scaffolds can be used to construct models that closely recapitulate the in vivo microenvironment, holding great promise for drug screening studies as well as platforms for understanding human physiology and disease.

FN-silke är ett rekombinant funktionaliserat silkesprotein som kan självorganisera sig till elastiska fibrillära 3D-matriser som främjar in vivoliknande interaktioner mellan celler och den extracellulära matrisen (ECM). Denna avhandling syftar till att öka förståelsen för hur FN-silke kan användas som ett biomaterial för att konstruera sådana fysiologiskt relevanta ECManaloger av interstitiella fibrernätverk och basalmembran, för applikation inom vävnadsteknik (tissue engineering). Detta undersöks både genom optimering av existerande metoder och genom utveckling av nya metoder för att konstruera FN-silkesmatriser, samt genom användningen av dessa som stödstrukturer för att utveckla in vitro-barriärvävnadsmodeller.

Specifikt beskriver Paper I en optimerad metod och Paper II en nyutvecklad metod för att förbereda konstgjorda basalmembran baserade på FN-silke. I Paper III beskrivs ett nytt sätt att framställa 3D-nätverk av FN-silke för användning som ECM-analog i in vitro- (Paper III) och in vivo-applikationer (Paper IV). Både det FN-silkebaserade membranet och 3D-nätverket används för att konstruera in vitro-hudvävnadsmodeller i Paper III, medan enbart FNsilkesmembranet används i Paper V som stöd i en alveolär-kapillär in vitromodell. Slutligen beskriver Paper IV användningen av 3D-nätverket som dermal stödstruktur i en in vivo-modell för sårläkning hos grisar.

I Paper I etablerades parametrarna för att förbereda FN-silkesmembran som stöttas av specialdesignade hållare (inserts). Detta resulterade i ett reproducerbart membran-insert odlingssystem där celler kan tillföras bilateralt. Detta system användes sedan i de applikationer som beskrivs i Paper III och V.

I Paper II utforskades en annan metod för att bilda FN-silkesmembran, denna gång runt hydrogeler. Funktionalisering med FN-silke ökade hydrogelernas likhet med naturlig vävnad, både genom modellering av basalmembranet och genom att åtgärda avgörande brister med hydrogeler, så som bristande celladhesion, inadekvata mekaniska egenskaper, samt ofördelaktig cellmedierad hydrogelkontraktion.

I Paper III presenterades och karaktäriserades FN-silke-baserade 3Dmodeller av hudvävnad. Primära humana celler odlades på FN-silkesmatriser, vilket resulterade i fristående dermala och epidermala modeller, samt i en dubbelskiktad dermal-epidermal modell. Dessa modeller uppvisar produktion av dermal ECM och mikrovaskulär-liknande strukturer, samt in vivo-liknande epidermal stratifiering och förhorning.

I Paper IV undersöktes den fördelaktiga interaktionen mellan hud och FNsilke i en in vivo-sårläkningsmodell i grisar. I jämförelse med en kommersiell dermal stödstruktur, uppvisade det FN-silke-baserade 3D-nätverket en snabbare återbildning av epitel och bättre mekaniska egenskaper hos de behandlade såren.

Slutligen, i Paper V jämfördes FN-silkesmembranet med ett kommersiellt syntetiskt membran som stödstruktur för en alveolär-kapillär in vitro-modell. Modellerna som var baserade på FN-silke uppnåde en högre nivå av likhet med riktig vävnad, med avseende på både morfologiska och funktionella egenskaper, jämfört med de kommersiella kontrollerna. Anmärkningsvärt var att de FN-silke-stödda cellodlingarna modellerade alveolbildning, vilket är första gången som detta observeras i en in vitro-modell.

Sammantaget bidrar arbetetet som utförts i denna avhandling till att öka kunskapen om potentialen hos FN-silke som ett biomaterial för in vitro- och in vivo-applikationer. Arbetet demonstrerar att de kemiskt definierade stödstrukturerna baserade på FN-silke kan användas för att konstruera modeller som mer tillförlitligt efterliknar mikromiljön in vivo, vilket är mycket lovande för läkemedelsscreeningstudier samt plattformar för att förstå mänsklig fysiologi och sjukdom.