Spatial organization of gene expression underlies how organisms interact, adapt, maintain homeostasis and health, and cause disease. Recent advances in spatially resolved transcriptomics have enabled unbiased, transcriptome-wide profiling directly in intact tissues, thereby preserving the tissue microenvironment in which biological interactions occur. However, most SRT applications have focused on single organisms, primarily mammalian tissues, leaving multi-organism systems, host–pathogen, multicellular pathogens, and host–microbe interactions less explored.

In this thesis, we develop and apply spatial molecular tools to investigate multi-organism interactions across different biological scales. We introduce methodological advances that enable spatial profiling of (i) dual host–pathogen transcriptomes, (ii) multicellular pathogens with their own tissue organization and symbionts, (iii) complex microbial communities in relation to adaptive immune responses, and (iv) custom probe design for probe-based Spatial Transcriptomics in non-model organisms.

In Article I, we developed Dual Spatial Transcriptomics (DualST), which enables the simultaneous and unbiased detection of host and pathogen transcriptomes in situ in clinical formalin-fixed paraffin-embedded samples. We applied DualST to human lung tissue infected with SARS-CoV-2 to map viral RNA localization and characterize the surrounding host response within the tissue microenvironment.

In Article II, we developed Miniature Spatial Transcriptomics (MiniatureST) to spatially resolve small multicellular pathogens using polyA-based RNA capture in a high-throughput manner. We applied MiniatureST to the parasitic filarial worm Brugia malayi, which causes lymphatic filariasis. This approach resolved the worm’s spatial transcriptomic architecture and enabled detection of its endosymbiotic bacterium Wolbachia, providing insight into the worm–endosymbiont interactions within the context of infection in the human host.

In Article III, we introduced Spatial metaTranscriptomics and Spatial VDJ (SmT-SVDJ), a method that combines microbial rRNA phylogenetic marker capture with enrichment of full-length B cell (BCR) and T cell (TCR) antigen receptor sequences, encompassing their V (variable), D (diversity), and J (joining) regions. This approach enables spatial mapping of microbial composition together with B and T cell clones, thereby linking microbiome organization to adaptive immune responses within tissues. We demonstrated SmT-SVDJ on two distinct human clinical samples, tonsil and breast cancer, unveiling microbiome-host-VDJ repertoire spatial profiles unique to each tissue type.

In Article IV, we developed Probe Spatial Transcriptomics (ProbeST), an open-source, scalable computational pipeline for designing custom gene-specific probe sets beyond human and mouse compatible with probe-based Visium Spatial Transcriptomics assays. A DualST experiment using ProbeST custom Salmonella pathogen probes together with the commercial mouse probe panel enabled simultaneous detection of host-pathogen transcripts, linking bacterial gene expression to localized host inflammatory responses. ProbeST expands probe-based Spatial Transcriptomics to non-model organisms and supports multi-organism and host–pathogen studies.

Together, these studies establish a framework for spatially interrogating host–pathogen, host–symbiont, and host–microbiome interactions. By developing adaptable molecular and computational tools, this work expands the application of spatially resolved transcriptomics to multi-organism systems and provides approaches that can be applied to diverse biological and clinical contexts.

Den rumsliga organiseringen av genuttryck ligger till grund för hur organismer interagerar, anpassar sig, upprätthåller homeostas och hälsa samt orsakar sjukdom. Nyliga framsteg inom rumsligt upplöst transkriptomik (SRT) har möjliggjort obiaserad, transkriptomomfattande profilering direkt i intakta vävnader och bevarar därmed den vävnadsmikromiljö där biologiska interaktioner sker. De flesta SRT-tillämpningar har dock fokuserat på enskilda organismer, främst däggdjursvävnader, vilket har lämnat multi-organismsystem, värd–patogen-interaktioner, flercelliga patogener och värd–mikrob-interaktioner mindre utforskade.

I denna avhandling utvecklar och tillämpar vi rumsliga molekylära verktyg för att undersöka multi-organisminteraktioner över olika biologiska skalor. Vi introducerar metodologiska framsteg som möjliggör rumslig profilering av (i) dubbla värd–patogen-transkriptom, (ii) flercelliga patogener med egen vävnadsorganisation och symbionter, (iii) komplexa mikrobiella samhällen i relation till adaptiva immunsvar, samt (iv) design av anpassade prober för prob-baserad Spatial Transcriptomics i icke-modellorganismer.

I Artikel I utvecklade vi Dual Spatial Transcriptomics (DualST), som möjliggör samtidig och obiaserad detektion av värd- och patogentranskriptom in situ i kliniska formalinfixerade paraffininbäddade prover. Vi tillämpade DualST på human lungvävnad infekterad med SARS-CoV-2 för att kartlägga lokaliseringen av viralt RNA och karakterisera det omgivande värdsvaret i vävnadens mikromiljö.

I Artikel II utvecklade vi Miniature Spatial Transcriptomics (MiniatureST) för att rumsligt kartlägga små flercelliga patogener med hjälp av poly(A)-baserad RNA-infångning med hög genomströmning. Vi tillämpade MiniatureST på den parasitiska filariemasken Brugia malayi, som orsakar lymfatisk filariasis. Denna metod kartlade maskens rumsliga transkriptomiska arkitektur och möjliggjorde detektion av dess endosymbiotiska bakterie Wolbachia, vilket gav insikt i mask–endosymbiont-interaktioner i samband med infektion i den humana värden.

I Artikel III introducerade vi Spatial metaTranscriptomics och Spatial VDJ (SmT-SVDJ), en metod som kombinerar infångning av mikrobiella rRNA-fylogenetiska markörer med anrikning av fullängds antigenreceptorsekvenser från B cells (BCR) och T cells (TCR), inklusive deras V (variabla), D (diversitets) och J (sammanfognings-) regioner. Detta tillvägagångssätt möjliggör rumslig kartläggning av mikrobiell sammansättning tillsammans med B- och T-cellskloner, vilket därmed kopplar mikrobiomets organisation till adaptiva immunsvar i vävnader. Vi demonstrerade SmT-SVDJ på två distinkta humana kliniska prover, tonsill och bröstcancer, och avslöjade mikrobiom–värd–VDJ-repertoarers rumsliga profiler som är unika för varje vävnadstyp.

I Artikel IV utvecklade vi ProbeST, en öppen och skalbar beräkningspipeline för design av anpassade genspecifika probpaneler utöver human och mus, kompatibla med prob-baserade Visium Spatial Transcriptomics-analyser. Ett DualST-experiment med ProbeST-designade Salmonella-prober i kombination med den kommersiella muspanelen möjliggjorde samtidig detektion av värd- och patogentranskript och kopplade bakteriellt genuttryck till lokala inflammatoriska värdsvar. ProbeST utvidgar prob-baserad Spatial Transcriptomics till icke-modellorganismer och stödjer multi-organism- och värd–patogen-studier.

Tillsammans etablerar dessa studier ett ramverk för rumslig analys av värd–patogen-, värd–symbiont- och värd–mikrobiom-interaktioner. Genom att utveckla anpassningsbara molekylära och beräkningsmässiga verktyg utvidgar detta arbete tillämpningen av SRT till multi-organismsystem och tillhandahåller metoder som kan användas i olika biologiska och kliniska sammanhang.