Enhancers regulate the frequency of transcriptional bursts from distal locations. While large- scale projects such as ENCODE phase 3¹ greatly expanded our knowledge of potential cis-regulatory elements by gathering ChIP-seq, ATAC-seq, Hi-C and ChIA-PET datasets among others, further functional validation of these regions is required.

In this project, we propose to investigate the function of potential enhancer regions associated to cardiovascular disease (CVD) risk using enCRISPRa/i method². Genome-wide association studies (GWAS) datasets were analyzed to select single nucleotide polymorphisms in human locus 9p21 associated to cardiovascular disease, and overlapped with HiCap data produced by Sahlén’s lab, enabling us to connect potential CVD-associated enhancer regions to their target genes.

We aim to establish two stable TeloHAEC (immortalized human aortic endothelial) cell lines expressing under doxycycline induction dCas9-activator and dCas9-repressor respectively. enCRISPR experiments can then performed by transfecting sgRNA vectors containing yet another activator/repressor, resulting in dual activation or repression of the potential enhancer region. Functional validation itself is done using qPCR to analyze the expression levels of target genes after enCRISPRa/i.

Within the given timeframe, the dCas9-modulator vectors needed for the enCRISPR experiment were prepared, isolated, and captured into lentiviral particles. Assembly of sgRNA vectors was optimized, and the transfection method was assessed. Viral particles are available for the final part of the study, namely transduction in TeloHAEC cells and qPCR.

Once completed, this study will enable the selection of confirmed enhancer regions for future experiments at Sahlén’s lab, including mutagenesis experiments in which the impact of CVD-associated SNPs in enhancer regions will be studied

Enhancers styr frekvensen av transkriptionstoppar från avlägsna DNA-regioner. Trots att storskaliga projekt som ENCODE fas 3¹ har kraftigt utökat vår kunskap om potentiella cis-regulatoriska element genom att sammanföra bland annat ChIP-seq, ATAC-seq, Hi-C och ChIA-PET datamängder, krävs ytterligare funktionell validering.

I det här projektet undersöker vi funktionen av potentiella enhancer regioner associerade med risken för hjärt-kärlsjukdom genom att använda enCRIPSRa/i metoden². Genomtäckande associationsstudier (GWAS) datauppsättningar analyserades för att välja enbaspolymorfier (SNPs) på mänskligt genom lokus 9p21 associerade med hjärt-kärlsjukdom, och överlappades med Hi-Cap data som producerats av Sahlén’s lab, vilket gjorde det möjligt att ansluta potentiella kardiovaskulär sjukdom- associerade enhancer regioner till deras målgener.

Vi strävar efter att etablera två stabila TeloHAEC (immortaliserade humana aorta endotelceller) cellinjer som uttryckes under doxycyklininduktion dCas9-aktivator respektive dCas9-repressor. Då kan enCRISPR-experiment utföras genom att transfektera sgRNA-vektorer innehållande en annan aktivator/repressor, vilket ska resultera i dubbelaktivering eller undertryckning av den potentiella enhancer regionen. Funktionell validering ska göras med qPCR för att analysera uttrycksnivåerna av målgener efter enCRISPRa/i.

Inom den angivna tidsramen förbereddes lentivirala partiklar med dCas9-modulatorvektorerna som var nödvändiga för enCRISPR-experimentet. Montering av sgRNA-vektorer optimerades och transfektionsmetoden bedömdes. Virala partiklar är tillgängliga för den sista delen av studien, nämligen transduktion i TeloHAEC-celler och qPCR.

När den är klar kommer den här studie att göra det möjligt att välja bekräftade enhancer regioner för ytterligare experiment vid Sahléns lab, inklusive mutagenesexperiment där effekten av CVD- associerade SNP i enhancer-regioner kommer att studeras.