A paradigm shift in the treatment of many genetic and acquired diseases is

underway. At the heart of this change are gene and cell therapies. They offer the

potential to cure many conditions that previously carried a poor prognosis. These

life changing therapeutics make use of complex biological modalities to target

underlying disease mechanisms, offering precise and effective treatments. The

complexity of these products, however, presents a barrier to their widespread

accessibility, in part due to the high cost of manufacturing.

Gene therapies use heavily modified viruses, called viral vectors, to insert

genetic material into a patient’s cells to restore normal function. The most used

viral vector in gene therapy is based on Adeno-associated virus (AAV). Currently

a major bottleneck for AAV-based therapeutics is their production. Not only does

the high manufacturing cost impact the accessibility of these treatments, the

limited production capacity reduces their availability.

Cell therapy is a broad category of innovative treatments that use cells as the

therapeutic substance. A category within cell therapy is immune cell therapy,

which uses cells from the body’s immune system to combat a wide range of

conditions, such as cancer, infectious disease, and autoimmune disorders. A

promising candidate in immune cell therapy are natural killer (NK) cells. These

cells are highly effective in the recognition and elimination of tumor cells, making

them a valuable tool in cancer immunotherapy. Though, like AAV-based

therapeutics, inefficiencies in their production limits their accessibility and

availability.

The aim of this thesis is to investigate these production bottlenecks and

provide potential solutions to overcome them. The first section investigates

methods to improve the scalability and efficiency of recombinant AAV (rAAV)

production, using techniques such as continuous manufacturing and

intensification. Continuous production is particularly well suited to the production

of rAAVs due to its ability to address critical challenges encountered during the

manufacturing process. Intensification offers an interesting complementary

approach to increasing the efficiency of rAAV manufacturing, by producing more

in the same amount of space. In papers I and II proof-of-concept systems were

developed that enabled the several fold increase in rAAV production.

The second part of this thesis focuses on the use of single-cell RNA

sequencing (scRNA-seq) to study processes in rAAV and NK cell production.

scRNA-seq is an advanced tool that gives an immense wealth of data that can be

used to gain deep insights into production processes. Previously, this tool has seen

limited use in process development, but the outcomes of papers III and IV show 

that it can be highly effective in this setting. Paper III highlighted a phenomenon

in the production of rAAV that severely limits production efficiency. In fact,

strategies were proposed that could potentially improve the production capacity

40-fold. Paper IV studied the donor-to-donor heterogeneity of a manufacturing

process for NK cells and identified key parameters that have the potential to

predict manufacturing performance. Additionally, these parameters could

potentially be used to not only monitor but to control the process, improving

yields.

This thesis investigates a wide array of topics in the field of gene and cell

therapies, from adherent cell culture to single-cell transcriptomics. It covers

aspects in process development of both gene and cell therapies, provides strategies

for the several-fold improvement of current rAAV manufacturing systems,

highlights a phenomenon holding back further advances in rAAV production and

suggests key process parameters that can be used to track and potentially improve

the performance of NK cell manufacturing.

Det pågår just nu ett paradigmskifte i behandlingen av många genetiska och

förvärvade sjukdomar. I centrum för denna förändring står gen- och cellterapier.

Dessa terapier har potential att bota många tillstånd som tidigare hade en dålig

prognos. Dessa livsförändrande terapier använder komplexa biologiska

modaliteter för att rikta sig mot underliggande sjukdomsmekanismer, vilket

möjliggör mer precisa och effektiva behandlingar. Komplexiteten hos dessa

produkter utgör dock en barriär för deras breda tillgänglighet, delvis på grund av

de höga tillverkningskostnaderna.

Genterapier använder kraftigt modifierade virus, så kallade virala vektorer,

för att införa genetiskt material i en patients celler och därmed återställa normal

funktion. Den mest använda virala vektorn i genterapi är baserad på

adenoassocierat virus (AAV). För närvarande är produktionen en stor flaskhals för

AAV-baserade terapier. De höga tillverkningskostnaderna påverkar inte bara

dessa behandlingars tillgänglighet, utan den begränsade produktionskapaciteten

minskar också tillgången.

Cellterapi är en bred kategori av innovativa behandlingar där celler används

som den terapeutiska substansen. En underkategori inom cellterapi är

immuncellterapi, där celler från kroppens immunsystem används för att bekämpa

en rad olika tillstånd, såsom cancer. En lovande kandidat inom immuncellterapi är

så kallade natural killer-celler (NK-celler). Dessa celler kan mycket effektivt

känna igen och eliminera tumörceller, vilket gör dem till ett värdefullt verktyg

inom cancerimmunterapi. Precis som för AAV-baserade terapier begränsar dock

produktionen tillgängligheten av och tillgången på dessa livsförändrande

behandlingar.

Syftet med denna avhandling är att undersöka dessa

produktionsbegränsningar och föreslå potentiella lösningar för att övervinna dem.

Den första delen undersöker metoder för att förbättra skalbarheten och

effektiviteten hos rekombinanta AAV (rAAV)-vektorer genom teknikerna för

kontinuerlig produktion och intensifiering. Kontinuerlig produktion kan vara

särskilt väl lämpad för produktionen av rAAV på grund av utmaningar vid

uppskalning. Intensifiering erbjuder en intressant parallell metod för att öka

effektiviteten i rAAV-tillverkning genom att producera mer i samma volym. I

artikel I och II utvecklas proof-of-concept-system som möjliggör en flera gånger

större rAAV-produktion.

Den andra delen av denna avhandling fokuserarfokuserade på användningen

av så kallad singelcellstranskriptomik för att studera processer inom rAAV- och

NK-cellsproduktion. Singelcells-RNA-sekvensering (scRNA-seq) är ett avancerat verktyg

som ger en enorm mängd data och kan användas för att få djup insikt i

produktionsprocesser. Tidigare har detta verktyg använts i begränsad omfattning

inom processutveckling, men resultaten från artikelartiklarna III och IV visar att

det kan vara mycket effektivt i detta sammanhang. Artikel III belyser ett fenomen

inom rAAV-produktion som begränsar produktionseffektiviteten. Här föreslås

strategier som potentiellt kan göra produktionskapaciteten 40 gånger större.

Artikel IV studerarstuderade variabiliteten i en produktionssprocess för NK-celler.

Nyckelparametrar identifieras som har potential att förutsäga

tillverkningsprocessens prestanda flera veckor i förväg. Dessa nyckelparametrar

skulle dessutom kunna justeras för att förbättra produktionsprocessen.

Denna avhandling berör en rad ämnen inom gen- och cellterapifältet, från

adherent cellodling till singelcellstranskriptomik. Den täcker aspekter av

processutveckling för både gen- och cellterapier, presenterarpresenterat strategier

för mångdubbel förbättring av nuvarande rAAV-tillverkningssystem, belyser ett

fenomen som begränsar ytterligare framsteg inom rAAV-produktion och föreslår

nyckelparametrar som kan användas för att övervaka och potentiellt förbättra

prestandan för produktionen av NK-celler.