Projektets mål var att producera utvalda BAR proteiner och förbereda prover för cryo-EM. Expressionskonstrukt av BIN1 isoform 1 och isoform 9, CIP4 och srGAP skapades och dessa proteiner producerades och renades. BIN1 isoform 1, isoform 9 och CIP4-NT* gav alla rent och stabilt protein. De tre proteinernas membranegenskaper testades med liposomer och avbildades med negativ färgning EM. Båda isoformerna av BIN1 kan skulptera membran till tubeli. BIN1 isoform 9 föreföll effektivare på att skulptera membran än isoform 1. För CIP4 var ingen interaktion var synlig, möjligtvis pga. inhibition av NT*-taggen. 

För att undersöka plana membransubstrat producerades spNW30 och spNW50 för att skapa NDs. ND:arna rekonstituerades enligt den publicerade metoden och avbildades med crypEM. Avbildningarna visade mestadels liposomer och mycket lite protein. Därför utvecklades ett snabbt arbetsflöde för rekonstituering av ND:ar som gav prov utan liposomer. Detta presterades genom att binda ND:arna till nickel-gel och tvätta bort liposomerna innan proteinet eluerades. Prover av de tvättade ND:arna avbildades med negativ färgning EM och föreföll endast innehålla ND:ar och tomt ND-protein. Ökningen av fluorescensen från Nile Red som adderats till reaktionerna kunde konstateras vara en pålitlig indikator för att påvisa rekonstituerade ND:ar. Med dessa verktyg analyserades olika förhållanden av protein till lipid, vilket ledde till en högre andel ND:ar.

The objective of this study was to produce selected BAR proteins for cryo-EM sample preparation.  Expression constructs for BIN1 isoform 1 and isoform 9, CIP4 and srGAP were created. The selected proteins were then expressed and purified. BIN1 isoform 1, isoform 9 and CIP4-NT* all yielded pure and stable protein. The membrane bending ability of these three proteins was tested with liposomes and imaged by negative stain EM. Both isoforms of BIN1 can bend membrane into protein decorated tubules. BIN1 isoform 9 appeared to be more efficient in bending membranes than isoform 1. No interaction could be seen for CIP4, possibly due to inhibition by the NT*-tag. 

To explore a planar membrane substrate, we produced the proteins spNW30 and spNW50 to form circular nanodiscs (cNDs). The cNDs were reconstituted according to the published method and imaged using cryo-EM. The images showed mostly liposomes and few cNDs. Therefore, we developed a fast workflow to monitor for ND reconstitution yielding samples without liposomes. This was achieved by binding the NDs to nickel-resin and washing away the liposomes before eluting the protein. Samples of the washed NDs were imaged using negative stain EM and appeared to only contain NDs and empty ND protein. The fluorescence difference when Nile Red was added to the reactions was found to be a reliable indicator for reconstituted cNDs. With these tools, different protein to lipid ratios were analysed, leading to a higher percentage of cNDs.