Amber suppression är en kraftfull metod för att utvidga den genetiska koden. Detta, möjliggör den platsspecifika inkorporeringen av en icke-kanonisk aminosyra (ncAA) istället för en amber stoppkodon. Med ncAA:erna kan nya funktionaliteter läggas till i en specifik protein, samt kan och denna syntetiska biologiska approach även vara en strategi för att förklara den molekylära funktionen hos proteiner i levande celler. I denna studie används amber suppression som en översättningsknapp: Genom att tillsätta ncAA möjliggörs nästan omedelbar translation av ett mRNA med en prematur amber-kodon som var ineffektiv tidigare. Studien syftar till att utforska tidsupplösta strategier för att förbättra kontrollen över kinetiken till en proteinpopulation och dess intracellulära dynamik.

För det första, utforskas insulinreceptorn som en potentiell reporter för övervakning av processen och transporten av komponenter i sekretoriska vägen. Vi skapade att skapa amber-suppression cellinjer genom genomisk integration av det ortogonala pyrrolysin tRNA / pyrrolysin tRNA syntetasparet. Då etableras snabb och reproducerbar proteinproduktion som svar på ncAA, vilket möjliggör att translational switch aktiveras (switch on). För det andra, bekräftar vår kinetikstudien, som involverar kromatinfaktorerna Daxx och Nanog, tidigare observationer och beskriver en fördröjd avstängning av translation vid byte av medium. Under denna fördröjningsfas fortsätter proteinsyntesen på grund av kvarvarande ncAA i cellen. Dessutom utforskade vi potentiella strategier för förkortning av lagfasen och därmed snabbare avstängning. Slutligen, visar undersökningen av tidsseriemasspektrometri en berikning av den märkta Nanog populationen genom kooimmunoprecipitation med potentiella interaktörer. Optimeringen av denna metod kommer att öppna möjligheter att validera nya proteininteraktioner och få djupare insikter i den molekylära funktioner och kromatindynamik, vilket är avgörande för molekylärbiologi och biomedicinsk forskning.

Amber suppression is a powerful method for expanding the genetic code, enabling the site specific incorporation of a non-canonical amino acid (ncAA) in response to an amber stop codon. With the ncAAs, new functionalities can be added to a protein of interest and this synthetic biology approach can even be a strategy for elucidating the molecular function of proteins in living cells. In this study, amber suppression is used as a translational switch: Supplementing the ncAA allows almost immediate translation of an mRNA with a premature amber codon that was unproductive before. The study aims to explore time resolved strategies to enhance control over a protein population kinetics and its intracellular dynamics.

First, the insulin receptor is explored as a potential reporter for monitoring the process and transport of the secretory pathway components. The generation of amber suppression cell lines through genomic integration of the orthogonal pyrrolysine tRNA / pyrrolysyl tRNA synthetase pair establishes quick and reproducible protein production in response to ncAA, allowing the translation switch to occur (switch on). Secondly, the kinetics study involving chromatin factors Daxx and Nanog confirms previous observations, describing a delayed switch-off translation upon media replacement. During this lag phase, protein synthesis persists due to remaining ncAA in the cell. Furthermore, we explored potential strategies for shortening of the lag phase and, consequently, faster switch off. Finally, the investigation of time course mass spectrometry demonstrates the enrichment of the tagged Nanog population through co immunoprecipitation with potential interactors. The optimisation of this method will open avenues for validating novel protein interactions and gaining deeper insights into the molecular function and chromatin dynamics, which are crucial for molecular biology and biomedicine research.