Proteiner förekommer i blodomloppet till följd av både aktiv utsöndring samt läckage från många av de celler som utgör kroppens vävnader och organ. Följaktligen kan proteiner ses som bärare av information gällande en människas fysiologiska tillstånd. Att tyda denna information är dock lättare sagt än gjort – ett proteins cirkulerande nivåer skiljer sig inte bara mellan individer, utan även hos en enskild individ över tid. Till följd av ny forskning som möjliggör egenprovtagning av blod som torkas på ett provkort (DBS) har dörrar öppnats för att på ett minimalinvasivt sätt erhålla prover från fler individer och tillfällen. Implementeringen av sådana verktyg skulle kunna innebära att proteiner i blodet kan studeras på ett mer representativt och inkluderande sätt. Det lung-specifika proteinet CC16 är ett av människans nästan tusentals cirkulerande proteiner. Detta protein har visat sig vara en biologisk variabel som potentiellt speglar fysiologiska förändringar i människans luftvägar, en så kallad biomarkör. 

Detta projekt syftar till att utveckla och optimera en immunanalys för att mäta CC16 i DBS. I förlängningen ämnar denna analys adressera de tekniska såväl som biologiska utmaningar som präglar forskning inom blodburna biomarkörer. 

Projektet delades upp i två faser. I den första fasen utfördes en serie av experiment för att utveckla ett protokoll för att på ett tillförlitligt sätt analysera CC16 i DBS-baserade eluat. Vi undersökte och optimerade processen för att genom eluering extrahera CC16 från DBS-matrisen. Baserat på dessa eluat utvärderade vi även en potentiell inverkan av denna provtyp på den immunanalys som tillämpats i detta projekt, då denna analys tidigare endast validerats för andra provtyper. Vi visade att analys av outspädda DBS-eluat ger mest tillförlitliga mätningar av CC16 med den tillämpade immunanalysen, men även att högre CC16-nivåer kan uppmätas genom optimering av elueringsprotokoll. Dessutom visade vi att vår immunanalys kan upptäcka subtila skillnader i CC16-nivåer i DBS-eluat. Detta är en viktig aspekt för kliniska tillämpningar, eftersom subtila förändringar i CC16-nivåer tidigare har visats associeras med förändrad lunghälsa. 

I den andra fasen av projektet tillämpade vi det protokoll som utvecklats under första fasen för att analysera egenprovtagna DBS-prover erhållna genom BAMSE-projektet – en longitudinell studie som har följt 4000 barn födda 1994–1996 i Stockholmsområdet. Vi kvantifierade CC16-nivåer i DBS-prover som genom egenprovtagning under COVID-19-pandemin samlades in från 56 deltagare vid tre separata tillfällen, 168 prover totalt. De erhållna resultaten påvisade ett brett spann av CC16-nivåer, vilka var i linje med de nivåer som tidigare har publicerats i studier som har uppmätt CC16 i venösa blodprov, såsom serum och plasma, tagna från friska och sjuka individer. Således kunde vi påvisa nyttan av att använda DBS-prover för att utföra longitudinella studier av biomarkörer. 

Sammanfattningsvis ger detta projekt en insikt i hur CC16-nivåer kan analyseras i eluat baserade på hemprovtagna DBS-prover från flera tidpunkter, men även i de utmaningar som bör beaktas vid utveckling av protokoll för analys av etablerade biomarkörer i nya provtyper.

Proteins secreted or leaked into circulation can be used as indicators of physiological and pathological processes of the whole human body. To fully understand the consequences of these indications, it is important to consider intra- and inter-individual differences in the levels of different circulating proteins. Self-sampling of volumetric dried blood spots (DBS) offers new routes for more frequent, inclusive and representative protein analysis. Among the many human proteins found in the circulation, the lung-specific Club Cell Secretory Protein (CC16) has emerged as a promising biomarker for respiratory health.

This project aims at developing and optimizing an immunoassay protocol for measuring CC16 levels in volumetric DBS and address the technical and biological challenges in targeted biomarker research.

First, we conducted a series of pilot experiments to develop a protocol for analyzing CC16 in DBS. We optimized the process to elute proteins from dried blood spot cards and evaluated potential matrix effects. We then adjusted the assay protocol to enhance sensitivity and reliability. Our findings demonstrated that for the chosen bead-based assay, undiluted DBS eluates provide the most reliable measurements of CC16. Furthermore, we demonstrated that the assay could detect subtle differences in CC16 levels in DBS eluates. This is an important aspect for clinical applications, since subtle changes in CC16 levels have been associated with altered states of respiratory health.

In a second phase of the project, we applied the optimized protocol to analyze DBS samples from participants of the BAMSE cohort, a longitudinal birth cohort study based in Stockholm. We quantified CC16 levels in 168 DBS samples collected at three different time points during the COVID-19 pandemic from 56 BAMSE participants. The results showed a broad range of CC16 levels, consistent with levels reported in previous studies that have analyzed CC16 levels in venous blood samples, such as serum and plasma taken from healthy and diseased individuals. Hence, we validated the utility of DBS for longitudinal biomarker studies.

We show the feasibility of analyzing CC16 levels in eluates from repeatedly self-sampled DBS, but also highlight critical areas to consider when developing a protocol for establishing protein analysis workflows for established biomarkers in novel samples matrices.