Den ökande förekomsten av antibiotikaresistens har framkallat ett växande behov av nya sätt att bekämpa infektioner. Även om vi förstår hur vissa antibiotika fungerar, är deras effekter på bakteriellt DNA ofta oklara. Denna information är avgörande för utvecklingen och tillämpningen av DNA-skadande ämnen såsom antibiotika. I detta projekt optimerades en fluorescensmikroskopi-baserad metod för direkt analys av kemikalie- eller antibiotikainducerade DNA-skador i bakterier. Den nya metoden utnyttjar enzymer från Base Excision Repair-systemet (BER), som är specialiserat på skador i enkelsträngat DNA, inklusive oxidativa lesioner. För att visualisera omfattningen av DNA-skador och deras reparation inkorporerades fluorescerande nukleotider i DNA:et, vilket möjliggjorde visualisering av skadan under ett fluorescensmikroskop. Liknande metod har tidigare använts för att undersöka DNA-skador in vivo, där både direkta och indirekta effekter av DNA-skdande ämnen detekteras. Målet med detta examensarbete var att att utveckla ett komplementärt protokoll för att specifikt undersöka de direkta DNA-skadande effekterna av stressfaktorer. För detta syfte optimerades och testades ett protokoll för in vitro-detektion av DNA-skador orsakats med väteperoxid och antibiotikum ciprofloxacin. Detta är första gången då in vitro avbildning av direkta stress-inducerade skador har upptäckts på enskilda DNA-molekyler i bakteria.

With the increasing prevalence of antibiotic resistance, there is an increasing need for new ways to fight infections. While we understand how some antibiotics work, their effects on bacterial DNA often remain unclear. This information is essential for the development and application of DNA damaging compounds such as antibiotics. In this project, we are optimizing a method using fluroscence microscopy to analyse direct bacterial DNA damage caused by stressors such as chemicals and antibiotics.The process utilized enzymes from the Base Excision Repair system (BER), which specialises in single strand DNA damage, including oxidative lesions. To visualise the extent of DNA damage and repair, fluroscent nucleotides were incorporated into the DNA, allowing us to visualise the damage under a fluroscent microscope. The method has previously been used to investigate in vivo DNA damage, which detects both direct and indirect effects of the investigated compound. This thesis aims to develop a complementary protocol to specifically investigate the direct DNA damaging effects of the stressors. To this end, a protocol for in vitro DNA damage detection was optimized and tested using hydrogen peroxide and the antibiotic ciprofloxacin. This is the first time that in vitro DNA single molecule imaging was used to detect direct DNA damage caused by stressors/antibiotics in bacterial DNA.